论文部分内容阅读
手性醇是合成大量重要手性药物的手型砌块。(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯((S)-CHBE)是一种多功能的手性中间体,尤其可作为降血脂药物阿托伐他汀钙的关键中间体。由于生物催化不对称还原法生产(S)-CHBE具有反应条件温和、对映体选择性高、副产物少,对环境友好等优点,已越来越受到人们的重视。本论文从Torulaspora delbrueckii ZJB15080中得到一个醛酮还原酶基因,并对它做了一系列的研究。主要研究结果如下:1.通过基因挖掘从T.delbrueckii ZJB15080中克隆了一株醛酮还原酶TdAKR,将其于大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中实现了异源表达,纯化后进行了酶学性质的研究。TdAKR分子量约为38.6 kDa,最适温度与最适pH分别为30℃、7.0。在低于35℃和偏酸性环境中稳定性较好。Td AKR遵循强制顺序反应。对4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)的最大反应速率(vmax)和对NADPH、COBE的表观米氏常数(Km)以及周转数(kcat)分别为47.51 U·mg-1,0.07 mM、1.19 mM和30.56 s-1。2.对重组菌的产酶表达条件进行了优化。确定了最佳产酶表达条件为:接种量2%,加入培养基37℃培养2 h后加入9 g·L-1的乳糖,诱导温度和诱导时间分别为28℃和12 h。此时比酶活达1932.6 U·g-1,生物量为1.92 g·L-1(DCW)。通过优化培养基组分,确定了加入10 g·L-1的蔗糖和5 g·L-1的NaNO3可使比酶活提高到2374.35 U·g-1,生物量2.1 g·L-1(DCW)。3.研究了TdAKR与EsGDH双酶偶联体系不对称还原COBE生成(S)-CHBE的过程。在50 g·L-1的底物浓度条件下,转化2 h后产物得率为91.5%,e.e.值95.6%,时空产率549 g·L-1·d-1。当底物浓度为75 g·L-1时,反应3 h后达到平衡,得率为90.3%,e.e.值95.7%,时空产率541.8 g·L-1·d-1。在底物浓度进一步增大为100 g·L-1时,反应在5.5 h后趋于平衡,此时产物得率为87.2%,e.e.值95.6%,时空产率380.7 g·L-1·d-1。而当底物浓度增大到125 g·L-1时,产物得率明显降低仅为64.8%。实验结果显示,TdAKR具有良好的应用潜力。