隐窝在小肠上皮细胞更新中起着非常重要的作用,但建立肠隐窝干细胞培养的方法较为困难。目前,已经报道了小鼠肠干细胞分离与培养的方法,仍然没有成功获得其传代细胞系,大动物肠隐窝干细胞分离培养体系也尚未报道。另外由于成体动物肠道微生物复杂,严重影响肠干细胞的分离。所以本研究建立胎牛空肠隐窝干细胞(Fetal bovine jejunal crypt stem cells)原代培养模型,并获得生物学功能稳定的胎牛空肠隐窝干细胞系。本试验选取3-6月龄的胎牛为研究对象,成功建立了一种新的原代肠干细胞培养模型,获得了生物学功能稳定的胎牛空肠隐窝干细胞系,并已经成功传至第40代,为其它动物体外建立分离培养模型及其干细胞系奠定基础。并初步建立了体外3D培养方法,为进一步研究EGF、LPS、VD通过Wnt/β-catenin信号通路对空肠隐窝干细胞模型分裂、增殖、分化的影响奠定基础。主要试验内容及结果如下:1.形态学分析。通过透射电镜、扫描电镜及HE染色,观察了十二指肠、空肠、回肠、结肠、盲肠的形态结构,对隐窝细胞进行定位,为后续分离空肠隐窝干细胞奠定了基础;2.分离培养胎牛空肠隐窝干细胞(Fetal bovine jejunal crypt stem cells)及其传代培养。选取3-6月龄胎牛的近端空肠(大约10 cm长)为试验样品。无菌条件下用手术刀片或无菌盖玻片刮擦空肠粘膜以除去上层粘膜和绒毛,再次刮取后用70 μm的细胞筛过滤,取未过滤掉的细胞;添加不同浓度FBS的DMEM培养基对胎牛空肠隐窝干细胞的影响。采用4种FBS浓度:5%、10%、15%、20%的DMEM培养基。当DMEM培养基中添加5%FBS时,培养的胎牛空肠隐窝干细胞增殖能力弱、集落不明显;添加10%FBS时获得增殖能力较强、集落较明显、纯度较高、生物学性状相对稳定的细胞;添加15%FBS时获得增殖能力强、集落明显、纯度高、生物学性状稳定的细胞;添加20%FBS时获得增殖能力强、集落明显、纯度高、生物学性状稳定的细胞,但夹杂许多杂细胞。结果表明,当DMEM培养基中添加的FBS浓度为15%时是胎牛空肠隐窝干细胞培养的最佳浓度;分离培养的胎牛空肠隐窝干细胞以及其传代细胞都具有良好的发育特征,并到目前为止成功将传代细胞传至第40代;3.胎牛空肠隐窝干细胞的鉴定。通过免疫组化技术及转录组测序分析,显示出Lgr5、Bmi1、LRIG1、CD166、MSI1、DCLK1、CD133、CD24在胎牛空肠隐窝干细胞中都有不同程度的表达,故该培养的细胞为空肠隐窝干细胞;4.分离培养成肌纤维细胞(Myofibroblast)及其传代培养。选取3-6月龄胎牛的近端空肠(大约10 cm长)为试验样品。无菌条件下用手术刀片或无菌盖玻片刮擦空肠粘膜以除去上层粘膜和绒毛,再次刮取后将组织剪碎至1 mm3。结果表明,分离培养的胎牛空肠隐窝干细胞以及其传代细胞都具有良好的形态学和生物化学特征并到目前为止成功将传代细胞传至第10代;5.不同添加物对胎牛空肠隐窝干细胞的影响。通过细胞划痕实验及Western Blot技术比较了添加 0、10、50 ng/ml的 EGF,0、10、100、1000 ng/ml 的 LPS 和 0、10、100、1000 nM的VD的DMEM完全培养基对胎牛空肠隐窝干细胞的影响。结果显示,当添加10ng/ml的EGF使受损的胎牛空肠隐窝干细胞恢复速率加快,促进受损后细胞的修复;添加10 ng/ml的LPS可抑制胎牛空肠隐窝干细胞生长;添加10、100、1000 nM的VD均可抑制胎牛空肠隐窝干细胞生长,而添加1000 nM的VD对胎牛空肠隐窝干细胞的生长速率抑制效果更明显;6.体外3D培养。从羊膜中提取基质胶并将其与隐窝悬浮液混合,形成基质胶滴。结果表明,培养7d后空肠类器官形成,生长状态良好。本研究已初步建立了体外3D培养方法。通过对隐窝细胞的定位及检测、体外分离培养及传代培养、免疫组化技术及转录组测序分析,鉴定该培养细胞为胎牛空肠隐窝干细胞,获得了胎牛空肠隐窝干细胞及其传代细胞系;通过细胞划痕实验及Western Blot技术比较了不同添加物对胎牛空肠隐窝干细胞的影响;通过从羊膜中提取基质胶,初步建立了体外3D培养方法。为其它动物体外建立分离培养模型及其干细胞系奠定基础。