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结核病是由结核分枝杆菌引发的一种历史悠久的慢性人畜共患传染性疾病,严重危害着人类的健康和畜牧业的发展。然而,结核病的防治工作仍然面临着巨大挑战,结核病的基础研究相对滞后,其胞内寄生机制、拮抗宿主吞噬、逃逸宿主免疫等机制仍知之甚少,极大地限制了对结核杆菌寄生宿主胞内和逃逸宿主免疫分子识别的认识,也使得抗结核药物筛选工作难以精准、有靶向性地开展。本研究开发验证了一套新的大规模的基于phi C31/att整合酶系统和高通量测序技术的酵母双杂交筛选系统（RLL-Y2H）,通过对该系统进行完善,分别构建了结核分枝杆菌膜蛋白、脂蛋白和分泌蛋白的Bait文库和宿主免疫相关蛋白的Prey文库,对结核杆菌和宿主蛋白互作的全局网络进行解析,并绘制了结核杆菌与宿主不同通路蛋白互作的子网络图谱。通过酵母双杂交、间接免疫荧光、双分子荧光互补、免疫共沉淀等研究手段对互作蛋白进行验证,并对其功能进行初步探究,使我们进一步了解结核分枝杆菌感染过程中的拮抗细胞吞噬、逃逸免疫清除的分子机制。此外,RLL-Y2H系统的建立和完善,不仅为结核-宿主互作组学研究奠定基础,也将极大地推动其他蛋白互作组学的研究,便于我们更加系统的剖析各种蛋白相互作用调控网络,更深刻地洞见生命活动的本质。主要内容如下:（1）新型RLL-Y2H筛选系统的可行性验证为了验证RLL-Y2H系统的可行性,我们将Matchmaker GAL4系统中的阳性对照互做蛋白SV40 large T和小鼠p53分别融合入RLL-Y2H系统中的pm GADT7和pm GBKT7载体,分别转化酵母Y187和Y2H菌株并进行杂交,发现RLL-Y2H系统中插入的元件不影响蛋白的表达和相互作用;随机挑取阳性克隆,对整合后的片段进行扩增,发现整合效率达到100%且融合片段序列正确无突变,证实RLL-Y2H系统在阳性互作蛋白对可行。（2）结核和宿主免疫相关通路蛋白酵母文库的构建分别取6-8周龄SPF级BALB/c小鼠的脑、肺、肝、肾、脾、淋巴结,进行组织总RNA的提取并反转成c DNA,设计合成374对含有同源臂和Mme I酶切位点的引物,以此鼠源c DNA为模板,采用同源重组的方法成功构建得到含有316个连接新型酵母表达载体pm GADT7的末尾含有Mme I酶切位点的宿主免疫相关蛋白ORFs的Prey文库,包括自噬相关基因,SNARE genes,TB susceptible genes,TLR Signaling genes,NF-k B Signaling genes,Jak/Stat Signaling:IL-6 Receptor Family genes,B Cell Receptor Signaling genes,T Cell Receptor Signaling genes。对Prey文库中的基因进行自激活活性检测,在后续的筛选过程中剔除具有自激活活性的基因。本课题组前期保存了以连接pc DNA3.1-V5/His B载体的结核分枝杆菌H37Rv蛋白ORFs的真核表达质粒为模板,采用同源重组的方法成功构建的542个连接新型酵母表达载体pm GBKT7的末尾含有Mme I酶切位点的结核分枝杆菌基因的Bait酵母文库,对Bait文库中的基因进行自激活活性检测,在后续的筛选过程中剔除具有自激活活性的基因。（3）结核杆菌与宿主蛋白互作网络图谱的绘制及验证将含有316个宿主基因ORFs的连接新型酵母表达载体pm GADT7的Prey文库和实验室保存的含有542个连接新型酵母表达载体pm GBKT7的结核分枝杆菌分泌蛋白、膜蛋白和脂蛋白ORFs的Bait文库进行杂交,收集所有阳性互作蛋白克隆,提取酵母质粒,以此酵母质粒为模板进行低循环PCR扩增,获得位点特异性重组后定向排列的包含互作蛋白核苷酸的新序列,即大小不同的“Prey-Mme I-ATTL-Mme I-Bait”片段,对PCR产物进行Mme I酶切,获得大小相同但序列完全不同的片段,回收酶切产物并连接高通量测序Illumina P5/P7 adapter,进行高通量测序。在4,600万条原始序列中,1,400万条可以映射为M.tb-宿主互作蛋白对。我们绘制了包含82个M.tb蛋白和128个宿主蛋白之间的总共1,438对互作蛋白全局网络图。基于互作蛋白对对应reads的数量计算了M.tb-宿主蛋白互作对出现的频率,剔除相互作用对的数量明显高于其他相互作用对的低测序频率（小于5）的互作对,同时剔除少量粘性蛋白质,即具有大量的相互作用蛋白（大于45）。根据过滤后序列及出现频率,最终绘制得到过滤数据后的M.tb蛋白和宿主免疫通路相关蛋白之间的包含441个互作蛋白对的互作网络图谱。随机挑取一定数量的测序互作对,采用经典的酵母双杂交方法进行一对一的验证,挑取的269对测序互作蛋白对中验证得到189对存在相互作用,阳性率为70.3%,进一步证实RLL-Y2H系统可行。（4）结核分枝杆菌与宿主蛋白互作的子网络图谱绘制基于结核分枝杆菌与宿主蛋白相互作用的全局网络图谱,分别选取宿主自噬通路、TLR signaling、NF-k B signaling、Jak/Stat signaling:IL-6 receptor family、B cell receptor signaling,T cell receptor signaling及结核易感基因,构建得到结核杆菌蛋白与宿主不同通路蛋白互作的子网络图谱及结核杆菌毒力因子与宿主蛋白互作的子网络图谱。（5）结核分枝杆菌蛋白干扰细胞自噬的初步探究实验室姚琪利使用CRISPR/Cas9系统构建了稳定表达GFPph-m Cherry-LC3(简称GphML)的RAW264.7细胞系进行自噬的分析。我们将与宿主自噬通路蛋白互作的子网络图中的共38个连接pc DNA3.1-V5/His B载体的结核杆菌真核表达质粒分别转染GphML-Raw264.7细胞系,雷帕霉素诱导自噬的发生,激光共聚焦显微镜观察M.tb蛋白的表达对细胞自噬的影响,发现结核杆菌Rv2427c可能通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用干扰WASP的功能,进而抑制自噬过程中吞噬体与溶酶体的融合。（6）结核分枝杆菌Rv3722c功能的初步探究挑取互作蛋白对中功能未知的结核分枝杆菌Rv3722c进行功能探究。酵母双杂交、间接免疫荧光、双分子荧光互补、免疫共沉淀实验证实,Rv3722c与TRAF3相互作用。激光共聚焦显微镜观察发现,Rv3722c促进结核分枝杆菌RFP-H37Ra在RAW264.7细胞中的增殖。双荧光素酶报告系统显示,Rv3722c促进HEK 293T细胞中NF-κB及TNF-α诱导的NF-κB启动子的活性;干扰HEK 293T细胞中TRAF3的表达,显著降低Rv3722c对NF-κB及TNF-α诱导的NF-κB启动子活性的激活。进一步探究其功能发现,Rv3722c不影响内源性TRAF3的泛素化,不影响IKBα的降解、NF-κB P65的入核和磷酸化。