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目的:脑缺血损伤是一种由多因素引起的神经疾病,常常会导致认知和记忆障碍,至今尚无有效的疗法。脑缺血会引起海马神经元死亡和细胞骨架系统异常。到目前为止,脑缺血后细胞骨架在神经元死亡进程中的具体变化仍不清楚。微管和肌动蛋白纤维(F-actin)是两种重要的细胞骨架,在神经元生长发育过程中扮演着重要的角色。本课题采用短暂性四动脉全脑缺血模型,检测微管和肌动蛋白纤维在缺血再灌注不同时间点的形态学变化,同时检测微管和肌动蛋白纤维相关调节蛋白的表达情况,从而探讨缺血再灌注之后微管和肌动蛋白纤维在神经元延迟性死亡进程中的变化规律。方法:本实验采用短暂性四动脉全脑缺血13min再灌注模型,通过NeuN染色和F-JB染色检测神经元损伤情况,应用鬼笔环肽特异性检测海马中F-actin的变化,应用MAP2和β-Tubulin检测海马中微管的变化;应用western blot技术检测全海马中cofilin、p-cofilin、β-Tubulin以及acetylatedαTubulin蛋白的表达情况。在此基础上通过体外实验直接检测微管和肌动蛋白纤维的形态学变化,从整体上探讨缺血再灌注后微管和F-actin在海马神经元延迟性死亡进程中的变化规律。结果:1、NeuN、F-JB以及MAP2免疫荧光染色结果显示:海马CA1区锥体神经元在缺血再灌注第2天死亡,随着时间的延长逐渐加重,在缺血再灌注第7天神经元死亡数量达到最大。2、鬼笔环肽检测技术揭示F-actin降解进程与海马神经元死亡进程一致。海马CA1区F-actin在缺血再灌注第2天明显损伤;在缺血再灌注第3天到第7天,F-actin损伤逐渐加重。此外在缺血再灌注第2天到第3天,海马CA1区辐射层中的F-actin典型的点状结构消失。3、Western blot检测cofilin和p-cofilin蛋白表达情况,结果显示:cofilin的表达水平在缺血再灌注第3天和第7天逐渐增高,然而p-cofilin的表达水平却逐渐降低。4、β-Tubulin的免疫荧光染色结果显示:与假手术组相比,海马CA1区辐射层中β-Tubulin的表达在缺血再灌注第1天轻微下降,第2天显著降低,之后进行性减少并消失。5、Western blot检测β-Tubulin和acetylatedαTubulin蛋白表达情况,结果显示:与假手术组相比,缺血组全海马中β-Tubulin的蛋白表达水平变化并不显著,但是acetylatedαTubulin的蛋白表达水平却在缺血再灌注第3天降低,在缺血再灌注第7天显著减少。6、体外实验结果显示:海马神经元用细胞松弛素D处理后,F-actin发生降解,MAP2相应减少,随着作用时间的延长,二者的损伤情况逐渐加重;海马神经元用诺考达唑处理后,MAP2和F-actin均减少,并随着作用时间的延长逐渐加重。结论:1、全脑缺血再灌注后,F-actin和微管进行性解聚,其空间演变和时间变化与海马CA1区神经元损伤相一致。2、缺血再灌注后激活的cofilin可能参与F-actin的解聚。3、微管乙酰化表达水平在缺血再灌注后降低,可能与微管的断裂有关。