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目的:非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH)是无过量饮酒史而病理学与酒精性肝炎相似,以肝细胞脂肪变性、小叶内炎症伴灶性坏死为特征的一类遗传-环境-代谢应激相关性临床病理综合征,常合并肥胖、糖尿病和高脂血症,其发病率逐年增高。研究证明约30% NASH患者可进展为肝纤维化,甚至肝硬化,而成为隐源性肝硬化的重要原因之一。目前,NASH的确切发病机制尚未完全阐明,Dye和James[1]提出的“二次打击”学说认为,胰岛素抵抗(insulin resistance, IR)、内毒素血症及炎症细胞因子等共同参与了NASH的病理生理环节。目前临床上药物治疗效果尚不理想。本研究采用高脂饮食建立NASH大鼠模型,通过检测血脂、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα, TNF-α)、内毒素及脂联素的表达水平,以探讨NASH的发病机制。同时应用微生态制剂(金双歧)进行干预性治疗,观察其对实验性NASH大鼠内毒素血症、脂联素及肝脏脂联素受体-2(adiponectin receptor-2, AdipoR-2)的影响,为今后NASH的有效防治提供新的思路。方法:健康清洁级雄性Wistar大鼠30只,体重140±10g,由河北医科大学动物实验中心提供。分笼饲养,每笼4-6只,按昼夜时程,在室温及稳定湿度条件下,用标准饲料喂养一周后,随机分为五组:a正常对照组6只:标准饲料喂养16周。b高脂模型组6只:高脂饲料(83%普通饲料+2%胆固醇+10%猪油+5%玉米油)喂养16周。c高脂+金双歧组6只:高脂饲料喂养12周后,给予金双歧(400mg/kg·d)灌胃,每日1次,共4周,其他组以相同剂量蒸馏水灌胃。d正常+内毒素组6只:标准饲料喂养16周后,给予LPS(1mg/kg)腹腔注射,a, b, c组以相同剂量蒸馏水腹腔注射。e高脂+内毒素组6只:高脂饲料喂养16周后,给予LPS(1mg/kg)腹腔注射,a, b, c组以相同剂量蒸馏水腹腔注射。于16周末股动脉放血处死正常对照组大鼠6只和高脂模型组大鼠6只,观察肝脏的大体形态,称肝湿重,留取血清及肝组织标本,以备血清学、肝组织病理及分子生物学指标检测。经肝组织病理检查证实16周时NASH大鼠模型已形成。高脂+金双歧组大鼠于12周开始给予金双歧(400mg/kg·d)灌胃,每日1次,共4周,其他组以相同剂量蒸馏水灌胃,16周末处死。正常+内毒素组大鼠于标准饲料喂养16周后给予LPS(1mg/kg)腹腔注射,6小时后股动脉放血处死留取标本。高脂+内毒素组大鼠于16周NASH模型形成后给予LPS(1mg/kg)腹腔注射,其他组以相同剂量蒸馏水注射,6小时后股动脉放血处死留取标本。取肝右叶组织3块,分别用于快速冰冻切片,行SudanⅣ染色,观察肝细胞脂变情况;10%的甲醛固定用于HE染色及Masson染色,观察肝组织的炎症、细胞病变及纤维化程度;余肝组织经液氮速冻后置于-80℃冰箱保存。测量体质量、肝指数(肝湿重/体重×100%),用日本Olympus AU2700全自动生化分析仪检测血清胆固醇(cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)水平;用显色基质鲎试剂定量检测血浆内毒素水平;用ELISA双抗体夹心法测定血清肿瘤坏死因子α(tumor necrosis actor alpha, TNF-α)的表达水平。HE染色观察肝组织普通病理变化;Masson三重染色观察肝纤维化程度;SudanⅣ染色观察肝细胞脂变的程度;用western blot方法检测肝组织AdipoR-2蛋白的表达水平。结果:1.实验大鼠的一般表现:正常对照组大鼠,食欲佳,皮毛光滑,精神状态好,体质量进行性增加;NASH模型组大鼠精神萎靡,活动减少,食欲减退,皮毛欠光泽,均呈明显腹型肥胖,体质量、肝指数与正常对照组相比显著增高(P<0.01);金双歧组大鼠精神、食欲及活动介于正常对照组与模型组之间,体质量、肝指数较模型组显著下降(P<0.01);内毒素组大鼠注射LPS后精神极度萎靡,反应迟缓,口唇青紫,毛色干枯,正常+内毒素组大鼠体质量、肝指数较正常对照组未见明显差异(P>0.05);高脂+内毒素组体质量、肝指数与正常+内毒素组相比显著增高(P<0.01),但与模型组相比无明显差异(P>0.05)。2.生化指标:NASH模型组大鼠血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)均显著高于正常对照组(P值均<0.01);金双歧组上述各指标均较模型组明显下降(P值分别为<0.01、<0.05、<0.05、<0.01);正常+内毒素组与正常对照组比较,上述指标无明显变化,差异无统计学意义(P值均>0.05);高脂+内毒素组与模型组相比,血清TC、TG表达水平无明显差异(P值均>0.05),ALT、AST水平显著升高,差异有统计学意义(P值均<0.01),但上述各指标均显著高于正常+内毒素组(P值均<0.01)。3.血清脂联素、血浆内毒素、血清TNF-α水平:与正常对照组相比较,NASH模型组大鼠血清脂联素水平明显下降(P<0.01),血浆内毒素(P<0.05)及血清TNF-α(P<0.01)水平明显增高;金双歧组与模型组相比血清脂联素升高,内毒素及TNF-α水平较前下降(P值分别为<0.01、<0.05、<0.01);正常+内毒素组大鼠注射LPS后血浆内毒素水平较正常对照组增高(P<0.01),而TNF-α及脂联素水平维持原水平;与之相反,高脂+内毒素组大鼠血浆内毒素及血清TNF-α水平较模型组明显升高(P<0.01),脂联素水平无显著性差异(P>0.05),与正常+内毒素组相比,血清脂联素水平下降(P<0.01),血浆内毒素及血清TNF-α水平均明显增高(P值分别为<0.05、<0.01)。4.肝组织病理学检查:肉眼观察,正常对照组大鼠肝脏外观为红褐色,明亮有光泽;模型组大鼠肝脏体积明显增大,颜色为浅黄至土黄色,与周围组织有粘连,切面油腻感,无光泽;金双歧组大鼠肝脏外观介于正常组和模型组之间;正常+内毒素组大鼠肝脏外观与正常对照组无明显差异;高脂+内毒素组大鼠肝脏外观与高脂组无明显差异。光镜下,HE染色示正常大鼠肝细胞索以肝小叶中央静脉为中心呈放射状排列,汇管区无明显炎细胞浸润,Masson三重染色示中央静脉及汇管区未见明显胶原纤维,SudanⅣ染色肝细胞胞浆中无红染脂滴;模型组大鼠肝组织HE染色示肝细胞浊肿,胞浆内充满大量脂肪空泡,可见小叶内点状或灶性坏死,以肝腺泡Ⅲ区最为明显,汇管区扩大并可见中性粒细胞等炎性细胞浸润,Masson三重染色示汇管区可见胶原纤维沉积,部分出现窦周及中央静脉周围纤维化,SudanⅣ染色可见肝细胞内充满橙红色脂滴,肝组织呈弥漫性脂肪变;金双歧组大鼠肝细胞病变、炎症活动度及脂肪变性、纤维化程度均较模型组显著降低;正常+内毒素组较正常对照组肝组织病理未见明显异常;而高脂+内毒素组HE染色可见肝小叶炎症较模型组加重,可见碎屑样坏死和桥接坏死,肝窦内有血细胞淤积,Masson三重染色及SudanⅣ染色示肝纤维化及脂变程度无明显差异。5.AdipoR-2蛋白在肝组织中的表达:与正常对照组相比较,模型组大鼠肝组织AdipoR-2蛋白的表达明显降低(P<0.01);金双歧可上调其表达(P<0.05);正常+内毒素组较正常对照组肝组织AdipoR-2蛋白的表达水平无明显差异(P>0.05);高脂+内毒素组与模型组相比无显著性差异(P>0.05),与正常+内毒素组相比其表达明显降低(P<0.01)。6.相关性分析:NASH模型组大鼠血清TNF-α水平与ALT、AST表达水平呈正相关(r值分别为0.940、0.970,P值分别为<0.01、<0.01);血清脂联素的表达水平与血清TG水平呈负相关(r值为-0.890,P<0.05),与肝组织AdipoR-2蛋白的表达呈正相关(r值为0.978,P<0.01)。结论:1.长期高脂高胆固醇饮食可成功建立NASH大鼠模型,脂质代谢紊乱是NASH发生和发展的重要机制。2. TNF-α及内毒素血症在非酒精性脂肪性肝炎发生发展中起着关键作用,并且NASH模型组大鼠对内毒素的敏感性明显增加。3.血清脂联素水平下降及肝组织AdipoR-2的表达减弱在NASH大鼠肝组织损伤方面发挥重要作用。4.微生态制剂可通过补充肠道正常菌群、抑制肠源性内毒素血症及TNF-α的合成和释放,最终达到防治NASH的作用,脂联素及其受体的表达增强是这一机制的中间环节。