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胸苷是抗艾滋病药物司他夫定（3’-脱氧-2’,3’-双脱氢胸苷）和叠氮胸苷的重要前体物质。本文应用代谢工程方法对Escherichia coli BL21（DE3）生物合成胸苷进行了较系统的研究，构建了一系列生产胸苷的菌株。研究考查了嘧啶核苷酸的回补途径与从头合成途径；考查了前体物NADPH和核糖-5-磷酸对胸苷积累的影响；还尝试了增加甘氨酸或天冬氨酸前体物来进一步提高胸苷的产量。最终通过分批补料发酵评价胸苷工业化的可能性。得到的主要结果如下：首先，考查了嘧啶核苷酸回补途径的胸苷积累的影响。采用组合敲除策略，敲除E. coli BL21嘧啶回补途径编码胸苷磷酸化酶、胸苷激酶和尿苷磷酸化酶的三个基因，分别是deoA、tdk、udp，构建了BS01(ΔdeoA)、BS02(ΔdeoAΔtdk)和BS03(ΔdeoAΔtdkΔudp)菌株，其中BS03工程菌株的胸苷分解途径完全被阻断，能够生产21.6mg/L胸苷。其次，为了增加合成胸苷前体物核糖-5-磷酸和NADPH的供给，在BS03的基础上进一步敲除EMP途径的pgi基因，使工程菌BS04胸苷的产量提高到78.7mg/L，其产量是BS03的3.6倍。结果表明pgi基因的敲除阻止葡萄糖-6-磷酸异构为果糖-6-磷酸，使葡萄糖-6-磷酸流向磷酸戊糖途径，增加磷酸戊糖途径的通量，为胸苷的合成提供更多的前体物。随后，为了解除嘧啶核苷酸从头合成途径中编码第一个关键酶（天冬氨酸氨甲酰基转移酶）的pyrBI操纵子的反馈阻遏，在BS04的基础上敲除了pyrB上游的调控序列pyrL，BS05可以积累90.5mg/L的胸苷。最后，进一步考查了胸苷合成途径的UDP到胸苷的核苷二磷酸还原酶(nrdA和nrdB)、核苷二磷酸激酶(ndk)、dUTP酶(dut)、胸苷酸合酶(thyA)和脱氧核糖核苷酸酶(ushA)。在p5C基础上插入大肠杆菌自身的ushA、thyA、dut和ndk，构建了pLS4质粒。在pTRC99A基础上插入nrdA和nrdB，构建pLM2质粒。在BS05基础上构建了BS06（pLS4）、BS07（pLM2）和BS08（pLS4pLM2）。BS06可以积累100.7mg/L的胸苷，BS07胸苷的产量达到169.2mg/L。而最终菌株BS08在摇瓶发酵条件下胸苷的产量可以达到272mg/L。通过分批补料发酵，BS08最终可以积累1248.8mg/L的胸苷，生产率达到15.61mg/(L·h),得率为12.5mg/(g·glucose)。本研究结果表明经过代谢工程改造的E. coli BL21具有良好的胸苷合成能力和应用潜力。