论文部分内容阅读
丙烯酰胺（AA）主要是由食物在加热和烹饪过程中,如油炸、烘焙或烧烤等,还原糖与天冬酰胺发生美拉德反应而产生。根据先前的研究,食物中如果含有AA可能会导致体内稳态紊乱、神经毒性、遗传毒性或生殖功能紊乱。而各种研究表明,丙烯酰胺可以迅速分布到肌肉组织,胃肠道、肺、皮肤和骨髓等多个组织或器官。丙烯酰胺通过在肠道中被细胞快速吸收,因此,有必要了解丙烯酰胺在肠道中的转运机制及其对肠上皮细胞转化途径的影响。黑灵芝多糖（PSG-1）是黑灵芝的主要生物活性成分。PSG-1及其主要酸性组分PSG-1-F2（PSG-F2）在体内外中均具有良好的抗氧化、免疫调节、抗癌、抗衰老、心血管保护和抗糖尿病活性。大量的的体外和体内实验已经证明,黑灵芝多糖能通过提高细胞抗氧化能力,保护丙烯酰胺诱导的肠道细胞及组织损伤,但是,黑灵芝多糖对丙烯酰胺所致细胞损伤的保护作用机制尚不清楚,有待进一步研究。因此本研究采用RNA-seq技术探讨了黑灵芝多糖对丙烯酰胺致细胞损伤的保护作用,其主要研究结果如下:1、基于RNA-seq分析PSG-F2对AA致IEC-6细胞损伤基因表达及其信号通路的影响。AA组共鉴定出1559个DEGs,其中上调621个,下调938个;320μg/m L PSG组共鉴定出1312个DEGs;上调540个,下调772个。与AA组相比,320μg/m L PSG组共鉴定出438个DEGs,其中133个DEGs上调,305个DEGs下调。对获取的转录组信息进行GO和KEGG富集分析。数据显示,自噬、凋亡和铁死亡基因在AA处理后显著上调,提示AA可能通过调节自噬和铁死亡对细胞产生毒害作用。其中,相关的信号通路有MAPK信号通路、细胞周期、Hippo信号通路等,而PSG-F2预处理可以通过细胞周期,MAPK信号通路、溶酶体、PI3K-Akt信号通路减少这种损害。2、MAPK信号通路作用的实验验证,结果表明:与对照组相比,IEC-6细胞在AA作用8h后达到半致死率,细胞皱缩,贴壁性变差,抗氧化酶系统SOD、GSH、线粒体膜电位MMP、细胞色素c、肠紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin 1等蛋白水平下降,与此同时,过氧化物产物MDA、线粒体mt ROS、细胞中p-p38、p-JNK、p-ERK等蛋白水平上升,说明AA能通过激活MAPK通路,造成细胞氧化损伤,导致屏障损伤。与AA组相比,PSG-F2减轻细胞形态损伤,提高细胞贴壁性,增强体内抗氧化酶系统SOD、GSH的活性,提高膜电位MMP、细胞色素c、ZO-1、Occludin、Claudin 1等蛋白水平,降低过氧化物产物MDA、线粒体mt ROS、降低p-p38、p-JNK、p-ERK等蛋白水平。说明PSG-F2预处理可以通过抑制MAPK通路,抑制AA导致的细胞氧化损伤和肠屏障损伤。3、验证细胞自噬和铁死亡的分子机制。实验结果显示,与对照组相比,AA提高IEC-6细胞中Fe离子浓度、脂质ROS水平、LC3、Beclin 1、PI3K、AKT、m TOR、Nrf2、SLC7A11、HO-1、COX-2等蛋白水平,降低GPX4蛋白表达,采用线粒体抑制剂mito-TEMPO（TEMPO）,可以降低线粒体ROS、MMP以及细胞色素c,同时降低细胞自噬蛋白LC3、Beclin 1以及细胞铁死亡蛋白COX-2,提高GPX4水平。表明抑制线粒体损伤,可以抑制细胞自噬以及铁死亡。采用溶酶体抑制剂CQ,可以降低细胞自噬蛋白LC3、Beclin 1以及细胞铁死亡蛋白COX-2、提高GPX4水平,降低Fe离子浓度,表明抑制自噬可以抑制铁死亡。上述结果表明,AA通过线粒体损伤,产生线粒体ROS,导致线粒体膜电位MMP下降、细胞色素c从线粒体释放,从而使脂质ROS积累,导致细胞氧化还原失衡,使自噬过量,造成细胞游离铁含量上升,激活Nrf2-SLC7A11-HO-1通路最终导致铁死亡。与AA组相比,PSG-F2降低了细胞中Fe离子浓度、脂质ROS水平、LC3、Beclin 1、PI3K、AKT、m TOR、Nrf2、SLC7A11、HO-1、COX-2等蛋白水平,提高了GPX4表达,说明PSG-F2有可能通过减缓线粒体损伤并激活PI3K-AKT-m TOR信号通路抑制细胞自噬及抑制Nrf2-SLC7A11-HO-1通路维持细胞铁稳态,控制细胞铁死亡。