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目的本课题组的前期工作发现高强度聚焦超声(High intensity focused ultrasound, HIFU)治疗肿瘤后,荷瘤鼠外周血淋巴细胞对早期的同种移植性肿瘤有明显的治疗作用。本研究拟进一步观察HIFU活化的外周血淋巴细胞对中晚期的同种移植性肿瘤的抗肿瘤效应,为阐明HIFU后荷瘤鼠淋巴细胞的免疫治疗作用提供实验室依据。方法1、小鼠H22移植性肝癌中晚期动物模型的制作180只正常C57BL/6J系小鼠,接种H22小鼠肝癌单细胞悬液0.05ml(6×107个/ml)于每只小鼠右侧背部皮下。分别在造模后第5、7、10、14、18、21、25、30天观察模型小鼠肿瘤成瘤率、体质量和肿瘤体积。然后“断颈法”每次处死20只小鼠,病理切片观察肿瘤组织及邻近脏器浸润、转移情况。2、HIFU治疗后外周血淋巴细胞对中晚期同种肿瘤的抗肿瘤效应50只正常C57BL/6J系小鼠,右侧背部皮下接种H22肝癌细胞株悬液0.05m(l6×107个/ml)后,随机分为以下5组:①空白对照组(n=10),小鼠接种肿瘤后第十天、第十一天,尾静脉注射生理盐水;②正常对照组(n=10),小鼠接种肿瘤后第十天、第十一天,尾静脉注射正常小鼠外周血淋巴细胞;③早期治疗组(n=10),小鼠接种肿瘤后第三天、第四天,尾静脉注射HIFU治疗后荷瘤鼠外周血淋巴细胞;④中期治疗组(n=10),小鼠接种肿瘤后第十天、第十一天,尾静脉注射HIFU治疗后荷瘤鼠外周血淋巴细胞;⑤晚期治疗组(n=10),小鼠接种肿瘤后第二十一天、第二十二天,尾静脉注射HIFU治疗后荷瘤鼠外周血淋巴细胞。各组小鼠分别接受尾静脉注射HIFU治疗后荷瘤鼠或正常小鼠外周血淋巴细胞液0.05ml(2×107/ml)、或生理盐水0.05ml,每天一次,连续注射2天。观察各组小鼠H22肿瘤发生率、肿瘤生长曲线、肿瘤消退率、小鼠生存率及生存曲线。结果1、小鼠H22移植性肝癌中晚期动物模型的制作造模第5天,即可见小鼠背部皮下有肿瘤生长,小鼠肿瘤成瘤率为88.9%。小鼠造模后从第5天始,体质量维持增长,至造模第10、21、30天分别达28.56±1.17g、31.39±2.45g和37.58±1.58g。造模第5天,肿瘤体积为156.09±54.40mm3,至造模第10、21、30天分别达619.62±179.21mm3,2288.93±525.42mm3和5391.48±1972.31mm3。病理学检查证实造模第5天,接种部位皮下有新生肿瘤形成;第10天,新生肿瘤开始侵犯邻近肌肉、血管和神经;第21天,肿瘤扩散范围更广,小鼠腹腔见少量癌性腹水;造模第30天,小鼠癌性腹水明显增加,伴有腹股沟淋巴结转移。2、HIFU治疗后外周血淋巴细胞对中晚期同种肿瘤的抗肿瘤效应①各组小鼠接种第5、10天的肿瘤发生率均为100%。②早、中期治疗组小鼠肿瘤生长缓慢,平均肿瘤体积均明显低于空白、正常对照组和晚期治疗组,差异有统计学意义;而晚期治疗组及空白、正常对照组小鼠的肿瘤体积基本相同,差别无统计学意义;早、中期治疗组两组比较,小鼠肿瘤体积在肿瘤接种第30天时有统计学差异,而第40、50天时无统计学差别。③接种肿瘤第70天时,早、中、晚治疗组和空白、正常对照组的肿瘤消退率分别为80%、10%、0%、0%和0%;与空白、正常对照组比较,早期治疗组肿瘤消退率明显增加,差异有显著的统计学意义(X2=16.9124,P=0.0001);与中期治疗组比较,早期治疗组肿瘤消退率也有显著的统计学差异(X2=11.0158,P=0.0009);而中期治疗组分别与晚期治疗组和空白、正常对照组比较,肿瘤消退率的变化无统计学差异(X2=1.4390,P=0.2303)。④早、中、晚期治疗组和空白、正常对照组小鼠70天存活率分别为80%、50%、0%、0%和0%;与空白、正常对照组和晚期治疗组比较,早期和中期治疗组小鼠70天存活率明显增加,差异有显著的统计学意义(早期,X2=16.9124,P=0.0001;中期,X2=8.6305,P=0.0033);而与中期治疗组比较,早期治疗组小鼠70天存活率的增加无统计学差异(X2=2.0269,P=0.1545);晚期治疗组分别与空白、正常对照组比较,小鼠70天存活率的差异无统计学意义(P=1)。结论1、造模第5～7天的小鼠H22移植性肝癌是早期肿瘤动物模型;造模第10～18天和第21～30天的小鼠H22移植性肝癌分别是中期和晚期肿瘤动物模型。2、HIFU治疗H22移植性肝癌后,荷瘤鼠外周血淋巴细胞对早期同种移植性肿瘤有明显的免疫治疗作用,对中期同种肿瘤的免疫治疗作用减弱,而对晚期同种肿瘤则没有明显的抗肿瘤作用。