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核苷磷酸化酶(Nucleoside Phosphorylase,NP)广泛存在于动植物器官和微生物中,在细胞核酸代谢尤其是核苷补救途径中起着十分重要的作用,是核苷酸补救合成途径的关键酶。嘌呤核苷磷酸化酶(Purine Nucleoside Phosphorylase,PNP)是核苷磷酸化酶家族的一个小亚家族,多年来研究表明,在哺乳动物和细菌中嘌呤核苷磷酸化酶参与核苷代谢,在临床上其缺失会引起多种疾病。本研究探讨毛果杨一个嘌呤核苷磷酸化酶Potri.013G100700基因功能,取得的主要研究结果如下: 毛果杨Potri.013G100700基因编码区全长CDS序列含999个核苷酸,编码333个氨基酸。同源性检索显示,拟南芥、大豆、小米等不同植物物种均存在其同源基因,结构域分析表明是嘌呤核苷磷酸化酶基因。序列对比显示,该基因编码蛋白的氨基酸在不同的植物物种中存在一定的保守性。 半定量RT-PCR分析显示,Potri.013G100700基因在毛果杨韧皮部高丰度转录表达,在老叶、木质部和根中转录水平较低;在毛果杨第1-6茎节、第9茎节、第12茎节中,Potri.013 G100700基因均有转录表达,在第1、4、5、6茎节转录水平较高,第9、12茎节转录水平次之,第2、3茎节转录表达最弱。 采用融合绿色荧光蛋白(GFP)策略,构建pG WB5-Potri.013G100700植物表达载体,在拟南芥中过量表达Potri.013G100700-GFP;激光共聚焦显微镜分析显示,在转基因拟南芥根组织细胞内具有绿色荧光信号,表明Potri.013G100700-GFP很可能定位于细胞质或细胞内膜系统。 通过转化拟南芥获得Potri.013G100700过量表达遗传材料,组织解剖学结合化学染色分析显示,与野生型相比过表达材料茎段细胞形态没有发生变化;然而,Potri.013G100700基因过表达拟南芥材料的根长与野生型拟南芥根长相比变短。这些结果表明,Potri.013G100700基因可能参与或影响根的生长。 此外,为了鉴定Potri.013G100700基因在毛果杨中的遗传功能,构建amiRNA-Potri.013G100700载体,并在84K杨中进行过量表达,经半定量RT-PCR鉴定后获得Potri.013G100700转录表达被高效沉默的转基因杨树株系。这为进一步鉴定该基因在杨树中的遗传功能提供遗传材料。