【摘 要】
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甘薯属于旋花科双子叶植物,其产量高、营养全面,富含氨基酸、维生素、蛋白质、花青素等多种营养成分,被世界卫生组织推荐为最佳食物。miRNA是生物体内普遍存在的、内源性的、非编码的单链RNA,其对生物的生长发育、形态建成、胁迫响应等多个生物过程具有重要的调控作用。miR172是高度保守的miRNA。miR172的靶基因是AP2/ERF家族基因。AP2/ERF是广泛存在于植物中的转录因子,与植物的生长发
【基金项目】
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国家重点研发专项（2018YFD1000705,2018YFD1000700）； 国家青年科学基金（31900450）； 山西省自然基金（201801D121238）； 山西省重点研发项目（201803D221008-6）； 山西省农业科学院应用基础研究计划（YG
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甘薯属于旋花科双子叶植物,其产量高、营养全面,富含氨基酸、维生素、蛋白质、花青素等多种营养成分,被世界卫生组织推荐为最佳食物。miRNA是生物体内普遍存在的、内源性的、非编码的单链RNA,其对生物的生长发育、形态建成、胁迫响应等多个生物过程具有重要的调控作用。miR172是高度保守的miRNA。miR172的靶基因是AP2/ERF家族基因。AP2/ERF是广泛存在于植物中的转录因子,与植物的生长发育和逆境胁迫密切相关。miR172通过作用于AP2调控植物花器官发育、开花时间、果实发育和逆境胁迫等多个方面。本研究首次从甘薯全基因组水平分析了miR172基因家族;克隆了Ib-miR172及其靶基因IbAP2;分析了Ib-miR172及其靶基因IbAP2在不同甘薯品种及不同组织中的表达情况;构建了p C2300-p OT2-Ib-pri-miR172和p C1300-IbAP2-GFP过表达载体;验证了IbAP2是Ib-miR172的靶基因。主要结果如下:1.Ib-miR172基因家族分析甘薯miR172基因家族共有3个成员,该3个miR172基因的前体序列均可以形成稳定的茎环结构。其中Ib-miR172a和Ib-miR172b分布在chromosome 3上,Ib-miR172c分布在chromosome 11上。在进化关系上,Ib-miR172a和Ib-miR172b聚类于同一进化分支上。Ib-miR172基因启动子序列上主要有12种顺式作用元件,主要包括干旱、低温等非生物胁迫响应元件。通过预测共得到20个miR172的靶基因,其中主要包括AP2基因家族。2.甘薯Ib-pri-miR172及其靶基因IbAP2的克隆及序列分析和载体构建分别从“徐紫薯3号”和“徐薯18号”中克隆了Ib-pri-miR172,其大小为421 bp。利用MEGA7.0对Ib-miR172与其他植物miR172成熟体序列进行多序列比对分析发现,miR172具有高度的保守性,构建了p C2300-p OT2-Ib-pri-miR172过表达载体。分别从“徐紫薯3号”和“徐薯18号”中克隆了IbAP2基因,其ORF为1395 bp,编码464个氨基酸。氨基酸序列中存在两个AP2结构域,并且在每个结构域中都存在一个YRG保守基序,属于AP2/ERF转录因子中的AP2（APETALA2）亚家族。IbAP2的DNA全长为3185 bp,含有10个外显子和9个内含子。该AP2转录因子为碱性不稳定亲水蛋白,不存在信号肽和跨膜结构域。三级结构显示该蛋白具有3个β-折叠和1个α-螺旋结构。在进化关系上,IbAP2与三叶裂薯的亲缘关系最近。IbAP2的启动子序列中包含MYB和MYC等转录因子结合位点的多种顺式作用元件。构建了IbAP2过表达载体p C1300-IbAP2-GFP。3.Ib-miR172及其靶基因IbAP2的表达分析利用q RT-PCR分析了Ib-miR172及其靶基因IbAP2在甘薯不同组织以及不同白心和紫心甘薯中的表达情况。利用烟草瞬时表达试验证明了IbAP2是Ib-miR172的靶基因。综上所述,本试验从甘薯全基因组水平分析了miR172基因家族,明确了Ib-miR172在甘薯基因组上的分布和在进化关系中的位置。利用q RT-PCR分析了Ib-miR172及其靶基因IbAP2在甘薯不同组织和不同甘薯品种中的表达情况,并进一步利用烟草瞬时表达验证了IbAP2基因是Ib-miR172的靶基因。克隆了Ib-pri-miR172及其靶基因IbAP2并构建了过表达载体p C2300-p OT2-Ib-pri-miR172和p C1300-IbAP2-GFP,为后期深入研究Ib-miR172及其靶基因IbAP2的生物学功能奠定了基础。
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