结核分枝杆菌四种蛋白抗原的克隆表达及血清诊断学评价

来源 :温州医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:dingdang7456
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长期以来,结核病都是对人类最主要的致命传染病之一。虽然近年来,结核病的死亡率有所降低,但是由于艾滋病的流行和结核分枝杆菌耐药性问题的日益严峻,结核病对人类健康的威胁仍然严峻。若要减轻结核病带给人类的负担,就需要弥补结核病早期诊断的不足。目前,临床上仍依赖以细菌学检测为金标准,以及临床症状结合PPD皮试和X线影像学检查诊断结核病。这一策略固然经典,但诊断时间较长,往往由于不能快速确诊而耽误了疾病的早期诊断和治疗。结核病的快速诊断方法一直是结核病防治领域的研究重点,其中血清学诊断方法由于其固有的优点,一直是研究结核病快速诊断方法的焦点之一。近年来,一些结核分枝杆菌特异性抗原被应用于结核病的血清学诊断中,然而,由于诊断的敏感性偏低,因此仍不能取代传统方法。血清学诊断技术的关键是提高抗原抗体反应的灵敏度和特异度,因此,寻找高敏感性和特异性的抗原至关重要。  本研究通过克隆、表达和纯化Rv2654c、Rv1789、Rv1985c和Rv3868四种结核分枝杆菌抗原,评价单种重组抗原的血清学诊断效能,以此为基础对不同抗原组合的诊断效能进行评价,并从中选出具有最佳诊断效能的抗原组合。首先以结核分枝杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到Rv2654c、Rv1789、Rv1985c和Rv3868完整目的基因,构建含目的基因的重组质粒,原核表达各重组蛋白,使用Ni2+亲和层析的方法对重组蛋白进行纯化,使用梯度透析方式对包涵体重组蛋白进行复性。然后,测定各重组蛋白的浓度,使用棋盘滴定的方式确定抗原最佳包被浓度,以及血清和二抗最佳稀释度。用各重组抗原分别对95份结核病人血清和95份健康人血清IgG进行ELISA检测,将数据汇入MedCalc统计软件进行分析,结合受试者工作特征曲线(Receiver OperatingCharacteristic Curve,ROC)对单种抗原的诊断效能进行评价。通过对单种抗原的检测数据进行整合,预测得到诊断效能最佳的抗原组合方案,最后通过对同样190份血清进行检测来验证该抗原组合的诊断效能。  通过上述实验方法成功扩增出Rv2654c、Rv1789、Rv1985c和Rv3868的完整基因,构建了重组质粒,经过与美国国立生物信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库中同一序列进行BLAST比对,两者完全一致。大量表达、纯化和复性获得高纯度的重组蛋白,浓度分别为1.64mg/mL、1.31 mg/mL、1.04 mg/mL和1.23 mg/mL。确定了最佳ELISA反应条件,Rv2654c、Rv1789、Rv1985c和Rv3868抗原最佳包被浓度分别为2.05μg/mL、1.64μg/mL、2.6μg/mL和3.08μg/mL。人血清和二抗的最佳稀释度分别为均为1∶100和1∶12500。用各重组蛋白建立优化的ELISA分别检测95份结核病人血清和95份健康人血清IgG抗体,经ROC曲线分析,单种抗原中,Rv2654c的诊断效能最好,灵敏度、特异度和约登指数分别达到57.89%、88.42%和0.4632;Rv1789诊断效能次之,其灵敏度、特异度和约登指数分别为55.79%、87.34%和0.4316; Rv1985c和Rv3868诊断的灵敏度、特异度和约登指数分别为51.58%和47.37%、86.32%和89.47%、0.3789和0.3684。对单种抗原检测数据进行组合分析,得到诊断效能最好的抗原组合为Rv2654c+Rv1789+Rv3868,其诊断的灵敏度、特异度和约登指数分别为78.95%、71.58%和0.5053。对该抗原组合进行验证试验,得到该组合诊断的灵敏度、特异度和约登指数分别为72.63%、74.74%和0.4737,经过kappa一致性分析,该组合检测结果与预测值具有较好的一致性。  本研究成功构建了pET32α-Rv2654c、pET32α-Rv1789、pET32α-Rv1985c和pET32α-Rv3868重组质粒,且能够正确、稳定地表达。纯化后的各重组抗原具有较好的诊断价值和应用前景,为结核病快速诊断技术的研究提供了依据。
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