论文部分内容阅读
解脂耶氏酵母作为一种安全的微生物，是目前研究报道最多的非常规酵母之一。作为一个优秀的发酵平台，已用于许多高附加值生物化学品的生产。β-胡萝卜素是一种四萜类化合物，作为色素或营养添加剂被广泛用于人类健康或动物饲养领域。本文以解脂耶氏酵母高效遗传操作工具的开发为基础，对在解脂耶氏酵母中构建高效的β-胡萝卜素合成途径进行了系列研究。 为了能够快速的对解脂耶氏酵母进行多重基因的整合，我们开发了“解脂耶氏酵母多重片段组装方法”。作为概念验证，在解脂耶氏酵母ATCC201249中，依赖内源同源重组作用，该方法可以实现在染色体的rDNA位点一步整合整条β-胡萝卜素合成途径（总长约11kb，含有四个基因模块，各模块间末端同源重叠序列长度为60bp），阳性率最高可达到20.9％，转化子最高β-胡萝卜素产量为2.22±0.34 mg/g干细胞。随后我们验证了该方法亦可用于其他不同株系的解脂耶氏酵母包括ATCCMYA-2613和ATCC76861。此外进一步验证了，利用该方法可以实现总长16kb包含6个基因模块的虾青素途径的一步整合。整个过程操作简便、用时少，使用该方法可以在解脂耶氏酵母中快速的进行异源代谢途径效率的比较筛选。 为了能够进行无痕编辑，我们为解脂耶氏酵母开发了高效的CRISPR-Cas9系统。其中，pCAS1yl质粒(不含有供体DNA)，在野生型菌株通过介导内源非同源末端接合作用，可以实现最高85.6％基因编辑效率。pCAS2yl质粒(含有供体DNA)，可以介导同源重组作用实现基因编辑，其中在ku70ku80双缺失菌株中编辑效率最高可达到94.1％。此外我们使用pCAS1yl系统，可以同时进行双靶点或三靶点基因编辑，效率分别可达到36.7％和19.3％，该系统可用于不同株系的解脂耶氏酵母基因编辑。使用pCAS2yl系统可进行高效的基因敲入，在ku70/ku80双缺失菌株中可获得70％的基因敲入效率。 为了验证油脂酵母是一个优秀的生产疏水性萜类化合物的底盘细胞，我们尝试通过代谢工程的方法实现β-胡萝卜素的异源高产。我们首先在解脂耶氏酵母中构建了一条来源于卷枝毛霉的由carRP/carB构成的β-胡萝卜素合成途径。进一步通过瓶颈步骤的鉴定、关键基因tHmgR和carRP的拷贝数调整和甲羟戊酸途径中7个基因过表达，最后在解脂耶氏酵母中构建了一条高效的β-胡萝卜素合成途径。最优菌株较出发菌株产量提高了100倍，高密度发酵可生产4 g/L的β-胡萝卜素，β-胡萝卜素主要储存在胞内的油脂颗粒中，该产量为目前报道的最高产量。