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目的
为了探讨凝固酶阴性葡萄球菌对氟苯尼考的耐药性及耐药基因的分布，研究氟苯尼考耐药机制及耐药性基因相关可移动遗传元件的结构，本文通过研究分离自中国多省市的动物源新鲜粪便（包括牛、鸡、鸭、猪）和温州地区海鲜市场（海产品胃肠道内容物）分离出的葡萄球菌，分析氟苯尼考耐药表型与耐药基因型相关性，研究氟苯尼考耐药基因fexA、cfr及其上下游可移动元件，分析耐药基因在不同菌株之间进行水平转移以及传播的分子机制。
方法
1.标本采集、分离纯化、鉴定：2016年从多省（四川、浙江、山西、山东和河南等）的多个养殖场采集鸭、牛、鸡、猪新鲜粪便标本，2018年从浙江温州菜市场采集新鲜海鲜标本，及时将标本送回实验室进行分离纯化；严格按照实验操作规程，采用革兰染色、生化反应、16SrRNA对标本进行鉴定。
2.药敏试验：参照CLSI以及EUCAST文件，采用琼脂稀释法对所分离得到的CoNS进行21种抗生素药物敏感性试验，分析不同来源菌株的耐药特点。
3.氟苯尼考耐药基因筛选：PCR筛选耐药基因(pexA，fexA，fexB，optrA，cfr，floR)，了解耐药基因在本文分离的葡萄球菌中的分布情况。
4.氟苯尼考耐药菌株克隆播散性：对23株CoNS氟苯尼考MIC≥32μg/mL进行脉冲场凝胶电泳（PFGE），分析菌株间是否有克隆播散。
5.cfr、fexA基因克隆：选取pET21b为载体，对三株葡萄球菌（H29、FC11、H37）的氟苯尼考耐药基因进行克隆，琼脂稀释法检测克隆子的MIC，验证耐药基因的耐药性。
6.H29测序及比较基因组分析：采用试剂盒提取基因组进行二代、三代测序，利用生物信息学软件进行序列拼接和ORFs注释；分析氟苯尼考耐药基因以及耐药基因以及相关的可移动DNA元件。
结果
1.标本采集、分离纯化、鉴定细菌：共分离到323株动物源性细菌以及73株海鲜源性细菌。分离得到39株CoNS（包括动物源28株，海鲜源11株）；其中有2株缓慢葡萄球菌，4株表皮葡萄球菌，6株马胃葡萄球菌，7株腐生葡萄球菌，4株松鼠葡萄球菌，3株溶血葡萄球菌，2株鸡葡萄球菌，3株葡萄球菌科氏亚种，4株沃氏葡萄球菌，以及未鉴别到具体种的4株葡萄球菌。
2.药敏试验：39株葡萄球菌中对氟苯尼考耐药（MIC≥32μg/mL）的有23株，耐药率为58.9%，且均为动物来源葡萄球菌；39株葡萄球菌对氯霉素耐药（MIC≥16μg/mL）的菌株有25株，耐药率为64.1%，其中动物来源葡萄球菌对氯霉素耐药的菌株有24株，海鲜来源葡萄球菌有1株。
3.氟苯尼考耐药基因筛选：动物来源28株葡萄球菌筛选到24株阳性菌株，共34个阳性目的基因：共有23株（82.1%）、5株（17.6%）、6株（21.4%）检测到fexA、fexB、cfr基因阳性菌株；其中携带单个fexA耐药基因的有13株，单个cfr耐药基因仅有1株；共同携带fexA和fexB有5株，共同携带fexA和cfr有5株，未检测到同时携带fexA、fexB和cfr耐药基因的菌株；4株（H4、H6、C10、H33）葡萄球菌没有携带已知的氟苯尼考耐药基因。海鲜来源葡萄球菌筛选的耐药基因较少，仅有三株（HXM5、HXM10、HXM13）为fexA阳性，阳性率为27.3%（3/11）。
4.氟苯尼考耐药菌株克隆播散性：PFGE结果显示23菌株有15个PFGE型，大部分条带分子量在20-700kb，条带数目在15-22条左右，没有发现克隆播散现象，电泳条带最高相似度（H37和FP36之间）也仅有63%。
5.cfr、fexA基因克隆：结果显示缓慢葡萄球菌fexAH29、cfrH29、cfrFC11基因有耐药性，耐药基因克隆株与对照菌株相比，氟苯尼考和氯霉素MIC值均提升了2-3个稀释度。
6.H29测序及比较基因组分析：葡萄球菌H29全基因组测序拼接结果显示，H29有两个成环质粒，大小分别为46kb和26kb。本文首次在缓慢葡萄球菌的质粒和染色体上中发现同时存在fexA和cfr基因，除含有fexA、cfr之外，基因组和质粒上还携带有其他耐药性基因。目前NCBI数据库与46kb质粒相比覆盖度≥70%的质粒有3个，架区域相似性可达99%以上；此外cfr、fexA基因上、下游都有转座子元件且上下游结构较为保守，与来源于其他菌株的相应序列相似性较高。
结论
1.动物源葡萄球菌对氟苯尼考、氯霉素、四环素、链霉素、林可霉素五种常用兽用抗生素出现了一定程度的耐药，且多数细菌存在多重耐药现象；海鲜源葡萄球菌大多数对多种。药物敏感，且耐药程度较低；可能是在动物养殖过程中使用抗生素量远多于海产品养殖，使得细菌在大量药物的选择性压力下获得更多抗性。
2.导致葡萄球菌对氟苯尼考、氯霉素耐药的主要分子机制是携带了相关耐药基因以及相关遗传元件，携带多个耐药基因菌株的MIC值大于携带单个基因菌株，说明极有可能是多个基因共同导致葡萄球菌对氟苯尼考、氯霉素耐药。
3.PFGE结果显示23株耐药性菌株中，有多个PFGE型，多株葡萄球菌相似度＜80%，可认为大多数菌株间不存在克隆播散性。
4.通过对H29染色体和质粒上的的cfr、fexA基因上下游结构分析，发现它们均与转座子相关，且相关结构在多个文献内被报道与耐药基因关联，因此推测这一耐药性基因可移动遗传元件可在不同种属菌株中发生播散。
为了探讨凝固酶阴性葡萄球菌对氟苯尼考的耐药性及耐药基因的分布，研究氟苯尼考耐药机制及耐药性基因相关可移动遗传元件的结构，本文通过研究分离自中国多省市的动物源新鲜粪便（包括牛、鸡、鸭、猪）和温州地区海鲜市场（海产品胃肠道内容物）分离出的葡萄球菌，分析氟苯尼考耐药表型与耐药基因型相关性，研究氟苯尼考耐药基因fexA、cfr及其上下游可移动元件，分析耐药基因在不同菌株之间进行水平转移以及传播的分子机制。
方法
1.标本采集、分离纯化、鉴定：2016年从多省（四川、浙江、山西、山东和河南等）的多个养殖场采集鸭、牛、鸡、猪新鲜粪便标本，2018年从浙江温州菜市场采集新鲜海鲜标本，及时将标本送回实验室进行分离纯化；严格按照实验操作规程，采用革兰染色、生化反应、16SrRNA对标本进行鉴定。
2.药敏试验：参照CLSI以及EUCAST文件，采用琼脂稀释法对所分离得到的CoNS进行21种抗生素药物敏感性试验，分析不同来源菌株的耐药特点。
3.氟苯尼考耐药基因筛选：PCR筛选耐药基因(pexA，fexA，fexB，optrA，cfr，floR)，了解耐药基因在本文分离的葡萄球菌中的分布情况。
4.氟苯尼考耐药菌株克隆播散性：对23株CoNS氟苯尼考MIC≥32μg/mL进行脉冲场凝胶电泳（PFGE），分析菌株间是否有克隆播散。
5.cfr、fexA基因克隆：选取pET21b为载体，对三株葡萄球菌（H29、FC11、H37）的氟苯尼考耐药基因进行克隆，琼脂稀释法检测克隆子的MIC，验证耐药基因的耐药性。
6.H29测序及比较基因组分析：采用试剂盒提取基因组进行二代、三代测序，利用生物信息学软件进行序列拼接和ORFs注释；分析氟苯尼考耐药基因以及耐药基因以及相关的可移动DNA元件。
结果
1.标本采集、分离纯化、鉴定细菌：共分离到323株动物源性细菌以及73株海鲜源性细菌。分离得到39株CoNS（包括动物源28株，海鲜源11株）；其中有2株缓慢葡萄球菌，4株表皮葡萄球菌，6株马胃葡萄球菌，7株腐生葡萄球菌，4株松鼠葡萄球菌，3株溶血葡萄球菌，2株鸡葡萄球菌，3株葡萄球菌科氏亚种，4株沃氏葡萄球菌，以及未鉴别到具体种的4株葡萄球菌。
2.药敏试验：39株葡萄球菌中对氟苯尼考耐药（MIC≥32μg/mL）的有23株，耐药率为58.9%，且均为动物来源葡萄球菌；39株葡萄球菌对氯霉素耐药（MIC≥16μg/mL）的菌株有25株，耐药率为64.1%，其中动物来源葡萄球菌对氯霉素耐药的菌株有24株，海鲜来源葡萄球菌有1株。
3.氟苯尼考耐药基因筛选：动物来源28株葡萄球菌筛选到24株阳性菌株，共34个阳性目的基因：共有23株（82.1%）、5株（17.6%）、6株（21.4%）检测到fexA、fexB、cfr基因阳性菌株；其中携带单个fexA耐药基因的有13株，单个cfr耐药基因仅有1株；共同携带fexA和fexB有5株，共同携带fexA和cfr有5株，未检测到同时携带fexA、fexB和cfr耐药基因的菌株；4株（H4、H6、C10、H33）葡萄球菌没有携带已知的氟苯尼考耐药基因。海鲜来源葡萄球菌筛选的耐药基因较少，仅有三株（HXM5、HXM10、HXM13）为fexA阳性，阳性率为27.3%（3/11）。
4.氟苯尼考耐药菌株克隆播散性：PFGE结果显示23菌株有15个PFGE型，大部分条带分子量在20-700kb，条带数目在15-22条左右，没有发现克隆播散现象，电泳条带最高相似度（H37和FP36之间）也仅有63%。
5.cfr、fexA基因克隆：结果显示缓慢葡萄球菌fexAH29、cfrH29、cfrFC11基因有耐药性，耐药基因克隆株与对照菌株相比，氟苯尼考和氯霉素MIC值均提升了2-3个稀释度。
6.H29测序及比较基因组分析：葡萄球菌H29全基因组测序拼接结果显示，H29有两个成环质粒，大小分别为46kb和26kb。本文首次在缓慢葡萄球菌的质粒和染色体上中发现同时存在fexA和cfr基因，除含有fexA、cfr之外，基因组和质粒上还携带有其他耐药性基因。目前NCBI数据库与46kb质粒相比覆盖度≥70%的质粒有3个，架区域相似性可达99%以上；此外cfr、fexA基因上、下游都有转座子元件且上下游结构较为保守，与来源于其他菌株的相应序列相似性较高。
结论
1.动物源葡萄球菌对氟苯尼考、氯霉素、四环素、链霉素、林可霉素五种常用兽用抗生素出现了一定程度的耐药，且多数细菌存在多重耐药现象；海鲜源葡萄球菌大多数对多种。药物敏感，且耐药程度较低；可能是在动物养殖过程中使用抗生素量远多于海产品养殖，使得细菌在大量药物的选择性压力下获得更多抗性。
2.导致葡萄球菌对氟苯尼考、氯霉素耐药的主要分子机制是携带了相关耐药基因以及相关遗传元件，携带多个耐药基因菌株的MIC值大于携带单个基因菌株，说明极有可能是多个基因共同导致葡萄球菌对氟苯尼考、氯霉素耐药。
3.PFGE结果显示23株耐药性菌株中，有多个PFGE型，多株葡萄球菌相似度＜80%，可认为大多数菌株间不存在克隆播散性。
4.通过对H29染色体和质粒上的的cfr、fexA基因上下游结构分析，发现它们均与转座子相关，且相关结构在多个文献内被报道与耐药基因关联，因此推测这一耐药性基因可移动遗传元件可在不同种属菌株中发生播散。