【摘 要】
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目的:构建张力诱导的人终板软骨细胞退变模型,解决力学敏感蛋白YAP1在循环张力条件下诱导人终板软骨细胞退变中的调控机制问题和探究潜在的治疗策略。方法:收集不同年龄段的腰椎间盘突出和骨折患者在我科接受手术的终板软骨组织,体外用FX-5000细胞应力加载装置加载人终板软骨细胞。在不同的牵张力强度的模型下,以5%伸长率、0.5Hz、12h/d,10%伸长率、0.5Hz、12h/d,15%伸长率、0.5H
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目的:构建张力诱导的人终板软骨细胞退变模型,解决力学敏感蛋白YAP1在循环张力条件下诱导人终板软骨细胞退变中的调控机制问题和探究潜在的治疗策略。方法:收集不同年龄段的腰椎间盘突出和骨折患者在我科接受手术的终板软骨组织,体外用FX-5000细胞应力加载装置加载人终板软骨细胞。在不同的牵张力强度的模型下,以5%伸长率、0.5Hz、12h/d,10%伸长率、0.5Hz、12h/d,15%伸长率、0.5Hz、12h/d的力学条件作用后通过Realtime RT-PCR验证人终板软骨细胞表型和YAP1的表达情况,并再次使用western blot方法进行验证,利用细胞染色观察软骨分泌并且利用免疫荧光观察力学刺激前后人终板软骨细胞的表型;选取目标YAP1进行人终板软骨组织和细胞进行实验,以组织Realtime RT-PCR、western blot方法验证不同分级下的人终板软骨的表达情况;再通过核质分离和免疫荧光观察YAP1的细胞核内与核外的表达;再构建人终板软骨细胞敲除和过表达模型与抑制剂和激动剂比较,蛋白表达和增殖改变情况采用western blot法检测;免疫共沉淀实验和双荧光素酶报告基因方法验证YAP1对Teads转录因子的结合作用以及YAP1对二型胶原和蛋白聚糖启动子的结合作用;并使用人终板软骨组织验证激动剂所带来的治疗效果分别通过组织学染色和免疫组化方法检测二型胶原和YAP1水平变化;最后验证YAP1上游并通过Realtime RT-PCR筛选出Piezo蛋白并使用对应抑制剂干扰Piezo1后观察软骨相关蛋白和YAP1水平变化。结果:越大的力学刺激作用,人终板软骨细胞表型表达最弱,对应的其表达水平随着力学强度的上升并且对应的时间增加呈现逐步降低的趋势,在对人终板软骨细胞的增殖方面可以发现10%的力学强度所达到的效果最好。终板软骨细胞中免疫共沉淀实验表明YAP1和Teads具有结合作用;通过抑制剂和慢病毒敲除YAP1后终板软骨细胞表型表达水平表达明显抑制,相反激动剂和慢病毒过表达YAP1后明显上升,通过双荧光素酶报告基因方法验证YAP1主要调控了终板软骨细胞表型的启动子从而作用于其基因表达;并且激动剂对终板软骨组织退变的程度有所缓解;最后通过检测Piezo的表达和last1的表达说明Piezo可以调控YAP1但并非通过Hippo通路。结论:力学刺激能够引起人终板软骨细胞发生退变,而10%的张力对人软骨终板的增值有着积极的作用;通过对YAP1过表达能够缓解终板软骨细胞退变程度。
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