本文主要目的是探索粘膜免疫策略与不同HIV免疫原顺序免疫策略诱导的免疫反应的特征，以寻求更有效的疫苗免疫策略；研究同时探索了既往献血人群HIV感染者人群分泌IFN-γ的HIV-1特异性T细胞反应的特征及与外周血CD4+T细胞计数和病毒载量之间的关系，以期为疫苗的研制提供更多基础数据。 对粘膜免疫系统的有效刺激需要两个条件，一是疫苗抗原能够有效的投递到粘膜淋巴组织；二是需要合适的粘膜载体或佐剂。 首先，探索了聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)作为粘膜佐剂与疫苗载体的作用。 第一步，以表达增强型绿色荧光蛋白的pEGFP质粒体外转染293T细胞为模型，优化PEI作为DNA疫苗载体的条件。利用流式细胞技术测定PEI/DNA复合体转染293T细胞的效率，转染效率表达为EGFP阳性细胞在所有细胞中的百分数；本研究探讨了不同N/P比值、不同复合体形成媒介、复合体不同保存时间及温度等因素对PEI/DNA转染效率的影响。研究结果表明，PEI/DNA的N/P比值为10∶1时，PEI转染的效率较高，与Lipofectamine的转染效率相当；150mmol/L NaCl和5％葡萄糖溶液作为复合体形成媒介，其转染效率优于其他所用媒介：PEI/DNA复合体在室温中保存15min时转染效率优于其他保存时间和温度。体外实验表明，PEI是一种相对安全、高效的非病毒基因载体。 第二步，在体外条件优化的基础上，采用PEI/DNA鼻腔粘膜初免和重组天坛痘苗肌肉注射给予系统加强的免疫策略、以HIV-1 Gag为免疫原，在BALB/c小鼠体内测试PEI作为粘膜佐剂与疫苗载体的效果。在第0、2、4周，以10μg DNA疫苗和相应的PEI复合体滴鼻免疫BALB/c小鼠，在第6周，以10<7>PFU的重组天坛痘苗肌肉注射加强免疫。研究结果表明，PEI作为粘膜免疫载体用于BALB/c小鼠初免时，ELISPOT与ICS结果分别为207±44 SFCs/10<6>个脾细胞与1.19±0.17％特异性CD3<+>CD8<+>T细胞，与裸DNA作为初免相比(ELISPOT与ICS结果分别为92±2 SFCs/10<6>个脾细胞，p=0.0404和0.60±0.06％IFN-γ+CD3+CD8+T细胞，p=0.0358)，显示PEI可以增强DNA疫苗的免疫原性。采用ELISA检测HIV特异性抗体，血清特异性IgG抗体在使用和不使用PEI的免疫组均为阳性，两组间强度无差别。PEI/DNA 3X/rTTV免疫组诱导的肺灌洗液特异性IgA抗体水平显著高于DNA 3X/rTTV免疫组(OD:1.39±0.22 VS 0.73±0.05，p=0.0445)，生殖道灌洗液特异性IgA抗体水平差异亦具有统计学意义(OD：2.01±0.16 VS 1.08±0.28，p=0.0469)。研究结果表明：PEI可以显著提高DNA疫苗的免疫原性，而且粘膜初免可以同时诱导粘膜和系统免疫力，系统加强可以同时提高粘膜免疫途径的体液免疫效果。 尽管PEI可以显著提高DNA疫苗的免疫原性，但是所获得的免疫原性与传统的肌肉途径进行DNA初免和病毒载体加强相比依然较弱，因而，探索能够进一步提高粘膜免疫原性的策略；与此同时，为提高疫苗接种的可行性与降低成本，同时测试减少疫苗免疫次数的可能性。在BALB/c小鼠采用重组痘苗滴鼻或DNA疫苗肌注初免，再用重组痘苗或DNA疫苗肌注加强的免疫策略来观察免疫效果。与重组痘苗滴鼻途径初免/重组痘苗滴鼻途径加强、DNA疫苗肌肉注射途径初免/重组痘苗滴鼻途径加强、DNA疫苗肌肉注射途径初免/重组痘苗肌肉注射加强等免疫策略相比，重组痘苗滴鼻与DNA疫苗肌注各一次，可诱导671±122 SFCs/10<6>个脾细胞，显著高于肌肉的常规DNA初免与加强策略(391±198 SFCs/10<6>个脾细胞)，更高于其他的策略与组合。与此同时，这一新策略诱导了最高水平的生殖道和第二高水平肺内的IgA抗体应答；诱导的IgG2a和IgG1水平相当(IgG2a.IgGl=1.2)，因此免疫反应兼具Th1型和Th2型；可以诱导高亲和力T细胞的表达；研究还发现重组痘苗滴鼻初免/DNA疫苗肌注加强组主要使用Vβ8.3受体(25.5％)，次要使用的受体是Vβ8.1/8.2(11.4％)，Vβ6(9.3％)，Vβ14(7.5％)和Vβ3(7.1％)。研究结果表明，重组痘苗滴鼻初免/DNA疫苗肌注加强的免疫策略免疫可以诱导相对最高水平细胞免疫和体液免疫，从安全性考虑，对载体进行进一步减毒是必需的。针对我国多种HIV-1亚型平行流行的特点，以活化针对病毒保守区为主、同时抗多种亚型的策略显得尤为重要。探索了以活化针对病毒保守区免疫反应为目标的、利用不同HIV免疫原进行顺序免疫策略，并与传统免疫策略之间诱导免疫反应进行了比较。将BALB/c小鼠随机分为以下5组：空载体对照组，来源于B′亚型免疫原的单独免疫组，来源于A/E、B′和B′C亚型免疫原顺序免疫的顺序免疫组1，来源于A/E、B′C和B′亚型免疫原顺序免疫的顺序免疫组2和各个亚型免疫原混合免疫的混合免疫组。在第0、2周肌注相应的DNA疫苗，第5周肌注相应的重组痘苗病毒疫苗，通过ELISPOT方法检测能够诱导小鼠脾细胞分泌IFN-γ的多肽表位，并对筛选出的阳性多肽进行亲和力的检测，从而推断不同免疫方式诱导细胞免疫反应谱和强度。研究结果表明，用不同HIV-1亚型来源的免疫原进行顺序交叉免疫能够逐渐提高机体针对各个亚型HIV-1抗原中共享的保守表位的免疫原性，进一步对表位在各亚型HIV-1抗原保守程度的分析发现，这一免疫策略诱导的主要是针对最保守表位的免疫反应，对非保守表位的免疫反应诱导能力则较弱。由于HIV自然感染时，针对一些高保守表位的T细胞免疫反应并不强，而该策略在提供针对各毒株的交叉免疫反应的潜能很大，提示顺序交叉免疫策略不失为一种诱导高保守表位T细胞免疫反应的新策略。 设计更佳的疫苗免疫策略需要人群样本的数据作为支持，使用覆盖HIV-1 B亚型病毒全基因组序列的肽库检测中国安徽阜阳市1992-1995年期间既往献血HIV感染者人群，分析分泌IFN-γ的HIV-1特异性T细胞反应的特征及其与患者外周血CD4<+>T细胞计数和病毒载量之间的关系。结果发现，6个月和12个月两次随访时，该人群CD4<+>T淋巴细胞计数与病毒载量之间均存在明显的负相关(r=-0.2725，r=-0.3351)，且具有统计学意义(p=0.0015，p<0.0001)。ELISPOT研究结果表明，全基因HIV特异性T淋巴细胞反应与病毒载量之间无相关性(6个月随访：r=-0.0535，p=0.5407；12个月随访：r=0.1366，p=0.1128)，进一步分析发现，部分肽池的HIV特异性T淋巴细胞反应强度与病毒载量之间存在明显相关性(Env 1与Gag 1)且具有统计学意义(p<0.05)。研究也显示，全基因HIV特异性T淋巴细胞反应强度与CD4+T淋巴细胞计数之间不存在相关性(6个月随访：r=-0.0426，p=0.6050；12个月随访：r=-0.0708，p=0.3942)。上述观察结果为研究T细胞免疫反应与疾病进展的关系积累了重要的数据，同时也为进一步探讨人HIV感染的保护性免疫机制提供了有益的线索。