动物的先天免疫系统作为广泛存在的天然防御机制,是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防线。程序性细胞死亡是多细胞生物生命过程中重要的生理或病理现象,更是宿主先天免疫防御病原入侵的重要环节。在与病原菌博弈的过程中,宿主会启动程序性细胞死亡,清除被感染的细胞和胞内的病原菌,并暴露病原,实现病原菌抗原信息呈递,激活适应性免疫,以促进病原清除和免疫防御。为了躲避宿主免疫识别,细菌也进化出多种机制,操控宿主细胞的死亡过程,以实现扩散感染,例如在感染早期抑制细胞死亡信号通路,实现入侵和胞内增殖,而在感染中后期诱导细胞死亡,实现扩散和进一步感染。探究细菌如何调控细胞死亡过程,对理解病原与宿主互作机制至关重要。杀鱼爱德华氏菌作为重要的海水养殖鱼类致病菌,多年来对其致病机制有了一定的研究,但是关于其调控宿主细胞死亡的研究却仍然匮乏。我们实验室在前期研究中,从杀鱼爱德华氏菌转座子插入失活文库中筛选得到了两株明显诱导细胞内容物如乳酸脱氢酶释放和形态学变化的突变株0909I和1906I。本课题利用这两株细菌突变株,进一步对它们诱导和调控细胞死亡的机制进行了深入研究,并考察了细胞死亡调控机制在细菌感染中的生理学作用。本论文发现0909I中转座子的插入导致了细菌溶血素编码基因ethA的转录上调,并通过细菌溶血素活性检测实验证实了 0909I是一株溶血素上调表达的菌株。杀鱼爱德华氏菌溶血素表达上调能够在多种鱼类非吞噬细胞上诱导caspase 5活性依赖的细胞死亡。溶血素定位实验发现,杀鱼爱德华氏菌溶血素会大比例与细菌外膜囊泡（Outer membrane vesicle,OMV）结合,结合溶血素的OMV孵育细胞后,能够直接诱导鱼类非吞噬细胞的焦亡样死亡。在细菌侵染过程中也发现,杀鱼爱德华氏菌溶血素依赖于与OMV的结合,通过dynamin依赖的细胞内吞方式,随着OMV的内化进入细胞,促进鱼类非吞噬细胞的焦亡样死亡。我们模拟病原菌感染鱼的天然方式,分别在斑马鱼幼鱼和成鱼上建立了细菌浸泡感染的肠道黏膜感染模型,发现杀鱼爱德华氏菌溶血素能够促进斑马鱼肠道炎症,加速宿主对杀鱼爱德华氏菌的清除,减弱杀鱼爱德华氏菌的毒力。这些研究结果揭示了杀鱼爱德华氏菌溶血素依赖OMV介导鱼类非吞噬细胞焦亡样死亡来调控鱼类先天免疫应答的致病机制,暗示低等脊椎动物也存在着与哺乳动物类似的非经典炎症小体信号通路。同时,本论文发现1906I中转座子的插入引起了细菌负责第二信使c-di-GMP（Bis-（3’,5’）-cyclic dimeric GMP）合成的双鸟苷环化酶的表达上调,导致了胞内c-di-GMP水平的增加,促进了杀鱼爱德华氏菌胞外多糖合成、生物被膜形成和黏附的增加。杀鱼爱德华氏菌c-di-GMP的上调还促进了 HeLa细胞上剧烈的膜破裂型死亡,限制了细菌在斑马鱼上的定植,降低了细菌的毒力。对细胞死亡类型的研究发现,杀鱼爱德华氏菌c-di-GMP介导的膜破裂型死亡不依赖于caspase、打孔蛋白gasdermin D/E,也不依赖于细胞坏死通路核心蛋白RIP1/RIP3或MLKL,而是铁依赖的一种氧化型的非经典铁死亡。杀鱼爱德华氏菌c-di-GMP能引起宿主细胞线粒体和胞质中的铁积累。当用铁螯合剂对游离的亚铁离子进行螯合后,细胞死亡被显著地抑制。C-di-GMP促进的铁积累能够诱导线粒体膜电位下降、ATP合成降低,促进线粒体和胞质中ROS积累,增大细胞氧化压力,诱导细胞死亡。更重要的是,本论文发现与经典的依赖于脂质过氧化的铁死亡不一致,在1906I感染的细胞中并没有检测到脂质过氧化的现象。脂氧合酶抑制剂、脂质抗氧化物也不能有效的抑制杀鱼爱德华氏菌c-di-GMP介导的铁死亡现象,进一步证实了杀鱼爱德华氏菌c-di-GMP介导的铁死亡不依赖于脂质的过氧化。本论文通过对杀鱼爱德华氏菌突变株0909I和1906I诱导细胞死亡调控机制的深入研究,揭示了杀鱼爱德华氏菌通过精密调控溶血素和c-di-GMP操纵细胞死亡过程、影响宿主免疫应答的感染策略,加深了对杀鱼爱德华氏菌与宿主互作机制的理解,为爱德华氏菌病的防治提供了新的视角。本论文发现了杀鱼爱德华氏菌溶血素依赖OMV介导鱼类非吞噬细胞焦亡样死亡,调控鱼类先天免疫应答,表明了低等脊椎动物中也存在着与哺乳动物类似的非经典炎症小体信号通路。杀鱼爱德华氏菌c-di-GMP失调在细胞上诱导了一种新型的不依赖脂质氧化的非经典铁死亡方式,这不仅丰富了对铁死亡在病原感染与宿主免疫防御中角色的理解,更揭示了一种新型的不依赖于脂质过氧化的非经典铁死亡途径的存在,对关于铁死亡的研究具有重要意义。