手性胺是一种重要的药物中间体,被广泛应用于医药、农业和化妆品等领域,据统计约40%的药物都含有手性胺这一功能性砌块。生物催化合成手性胺具有反应条件温和、过程简单、立体选择性高等优势,正逐渐成为一种非常具有吸引力的合成途径。在众多合成手性胺的生物催化剂中,转氨酶因其大小口袋作用机制具有严格的立体选择性,而且无需额外的辅酶循环,具有很好的工业应用潜力。但是天然转氨酶一些固有的缺陷,包括不接受工业青睐的廉价胺供体异丙胺（IPA）、高浓度底物耐受性差以及对非天然大分子底物催化效率低等,严重阻碍了其工业化应用。针对上述问题,本论文通过定向宏基因组策略和理性设计方法,主要在具备工业化应用潜力的转氨酶的高效挖掘、转氨酶介导的手性胺绿色合成工艺的建立和胺化非天然大分子底物转氨酶的理性改造三个方面进行了研究,具体阐述如下:1)底物和异丙胺高耐受ω-转氨酶的挖掘:由于天然ω-转氨酶的稳定性普遍较差,无法耐受高浓度酮底物和廉价胺供体IPA,所以底物载量和平衡抑制问题成为了掣肘ω-转氨酶工业化应用的重要因素。为了获得能够高效胺化高浓度酮底物且对IPA亲和性良好的ω-转氨酶,我们采集了全国23个省市的富含胺类农药的混合土样建立了土壤宏基因组。我们推测,特殊自然环境生态位微生物群系所含相关蛋白通过自然进化会形成天然的定向进化突变库,一些性能优良的ω-转氨酶极有可能在微生物经受自然选择时演化出来,而高通量测序技术的快速发展为高效挖掘这些目标转氨酶提供了基础。最终,通过充分的挖掘我们鉴定了一个稳定性极好的能够耐受高浓度底物和IPA的高效（S）-ω-转氨酶ATA1012。首先,它在30-50℃下表现出显著的稳定性,50℃时半衰期长达160小时,30℃时半衰期甚至长达800小时,对工业过程操作的连续性非常有利。其次,它能够接受并耐受高达2 M的胺供体IPA,有效解决了天然ω-转氨酶不接受和不耐受高浓度IPA作氨基供体的限制;更进一步,相比大部分ω-转氨酶需要10-200倍当量IPA来克服平衡抑制并获得目标转化率（＞90%）,该酶仅需2倍当量即可实现高达100%的转化率,有效解决了 ω-转氨酶固有的反应平衡问题。第三,相较于其它大部分天然ω-转氨酶只能催化不超过100mM的底物,ATA1012对高达750 mM的靶向酮底物1-Boc-3-哌啶酮和1-Boc-3-吡咯烷酮表现出良好的底物耐受性和催化性能。通过系统的优化各项反应参数包括底物载量、反应温度、IPA用量以及辅酶浓度（5’-磷酸吡哆醛,PLP）,该酶能够在12小时内高效胺化0.75 M的1-Boc-3-哌啶酮（150 g/L）和1-Boc-3-吡咯烷酮（139 g/L）,转化率分别达到100%和98.9%,产物ee值均大于99.9%。分子对接和分子动力学模拟分析进一步揭示了 ATA1012高效催化目标底物的分子机制。通过定向宏基因组策略,该部分工作有效解决了 ω-转氨酶不耐受高浓度底物以及不利的反应平衡问题,为转氨酶的工业化应用提供了一个绿色高效的生物催化剂和可持续的手性胺合成工艺,为高效酶制剂的挖掘提供了有效的参考。2)转氨酶不对称合成广谱型除草剂L-草铵膦（L-PPT）的应用研究:L-PPT是一种非天然α-氨基酸来源的广谱型除草剂,通过抑制植物的光合作用发挥除草效用,应用前景非常广泛。为了获得能够高效不对称胺化高浓度草铵膦前体酮酸（PPO）一步生成光学纯L-PPT的底物高耐受α-转氨酶,我们对上述宏基因组进行充分地挖掘并构建了包含102个S型α-转氨酶的转氨酶酶库,然后以高浓度PPO为氨基受体,并分别以L-丙氨酸（L-Ala）和L-天冬氨酸（L-Asp）为氨基供体,对该酶库进行筛选,最终获得了两个对PPO耐受性和催化活性良好的S型转氨酶ATA0611和ATA1042,二者均可不对称催化0.5 M的PPO生成相应的光学纯胺产物L-PPT,转化率分别可达78%和90%。为了解除转氨酶固有的平衡限制,进一步提升反应的转化效率,丙酮酸脱羧酶（PDC）级联体系被引入反应系统,通过移除副产物丙酮酸使反应平衡右移获得更高的转化率。同时,转氨酶和PDC共表达体系被建立用以提升反应的传质效率。通过优化各项反应参数,共表达酶ATA0611-PDC可在30小时内将0.5 M PPO全部转化完,氨基供体L-Ala当量为2.4倍,产物L-PPT的ee值为99.88%;而另一个共表达酶ATA1042-PDC可在24小时内同样地将0.5 M PPO全部转化完,仅需2倍L-Asp作胺供体,产物L-PPT的ee值大于99.9%。鉴于ATA1042-PDC相对优越的催化特性,其还被用于0.5 L和10 L反应规模的放大试验,22h转化率皆可达100%,重复度良好。二者催化的底物浓度（100 g/L）是目前生物合成中所报道的最高水平,中试放大试验也证明了其具有潜在的工业应用潜力,该部分工作为光学纯精草铵膦的绿色合成工艺提供了两种可参考的合成路径,并再次验证了定向宏基因组策略在挖掘高效生物催化剂方面的实用性。3)基于提高ω-转氨酶对非天然大分子底物催化活性的理性改造研究:由于天然ω-转氨酶的小口袋一般只能容纳一个甲基,其对非天然大分子底物较低的催化活力也是阻碍ω-转氨酶工业化应用的重要原因。为解除这个限制性因素,该部分工作以不被大多数天然ω-转氨酶所接受的芳基烷基类前手性酮1-苯丙酮为模式底物（对应的手性胺（S）-1-氨基-1-苯基丙烷是一种抗抑郁药的重要手性前体）,并以对1-苯丙酮显示痕量活性的一个来源于瘤状伯克霍尔德菌株（Paraburkholderia phymatum）的（S）-ω-转氨酶（BPTA）为理性改造对象,通过重塑BPTA的大口袋,解除了由小口袋引起的固有限制,实现了1-苯丙酮的高效胺化。分子对接和分子动力学模拟结果显示,该野生型转氨酶与底物的结合是非经典的催化构象,即底物的大小基团偏离了转氨酶对应的大小活性口袋,而大口袋存在的空间位阻W82以及小口袋氨基酸残基F44与底物苯基之间不利的相互作用是导致该酶催化效率低的主要原因。首先,通过引入更小的氨基酸残基W82A解除空间位阻,突变体活性相比野生型提高了 14倍;然后,由于F44位于二聚体界面,对酶的稳定性、催化活性和立体选择性至关重要,我们在其相反方向引入M78F和I284F提供π-π堆积相互作用,增强底物苯基与大口袋之间的亲和力,抵消F44产生的不利相互作用,得到了经典的底物结合构象;进一步引入T440Q,在靠近活性位点入口处提供更加疏水和灵活的环境,增强了底物亲和力。最终的四点突变体M78F/W82A/I284F/T440Q其催化构象是最高效的。相比于野生型,该突变体对目标底物1-苯丙酮的催化活力提高了 470倍,转化率由1.3%提高为94.4%,且立体选择性未发生变化（ee＞99.9%）。同时,所获得的突变体对其它一系列小基团大于甲基的芳基烷基类底物的催化活性也有显著提高,相比野生型催化活力提高了 104～230倍。该部分工作有效解决了天然ω-转氨酶对非天然大分子底物催化活力低下的限制,为其它具有类似非经典底物结合构象的ω-转氨酶的改造提供了一种可行的思路。