论文部分内容阅读
背景及目的:肝癌是严重危害人类健康最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在所有肿瘤中居第五位,死亡率居第三位,其中HBV相关性肝癌在我国的发病率尤其高。目前,对肝癌的治疗措施主要还是以早期手术切除为主,辅以化疗、放射治疗、免疫治疗等方法,但是因为肿瘤转移和复发的原因,效果仍不理想。HBV编码的乙肝病毒x蛋白(hepatitis B virus x protein,HBx)通过多种途径发挥致癌作用,如调节肿瘤细胞的凋亡,参与信号通路调节,通过反式激活原癌基因的表达,从而导致肿瘤的发生发展。近来研究发现骨桥蛋白(osteopontin,OPN)通过调节上皮间质可塑性促进肿瘤转移,对肿瘤细胞的侵袭能力有重要促进作用。OPN还可通过特异的精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸(Arg-Gly-Asp,RGD)序列改变细胞骨架、调节MMP-2、MMP-9的活性、与细胞膜上受体CD44及整合素结合等方式来促进肿瘤细胞的迁移与侵袭。同时有报道,OPN能够上调乳腺癌干性相关转录因子的表达以及促进乳腺癌间充质干细胞向癌症相关成纤维细胞的分化。近年来研究还发现,恶性肿瘤内含有癌干细胞,与肿瘤的发生发展密切相关,是肿瘤复发转移的主要原因。肝癌干细胞通常具有多种干性标志物,如CD44、CD90、CD133、EpCAM(CD326)以及OV6,常用于实验研究中的干性标志物是CD44、EpCAM。但是关于骨桥蛋白在HBV相关性肝癌中的作用,特别是对肝癌细胞干性影响中的作用如何目前尚不清楚。HBx能否上调OPN的表达,增强肝癌细胞干性,从而促进HBV相关性肝癌(HBV-HCC)复发转移是尚待解决的问题。为此,本研究首先在HBV阳性及HBV阴性肝癌患者的癌组织标本中,针对OPN的表达与患者性别、年龄、甲胎蛋白(AFP)等临床病理因素之间的关系进行了系统的分析;其次在培养的各肝癌细胞系中对HBx与OPN表达、HBx与肝癌细胞干性标志物、HBx与干性相关转录因子的关系作了进一步的研究,细胞侵袭实验研究了HBx对肝癌细胞侵袭性的影响,以期阐明OPN在HBx上调肝癌细胞干性的作用、增强肝癌细胞侵袭的机制,为HBV-HCC的防治提供新的实验依据。主要研究内容及方法:第一部分肝癌组织中OPN的表达与临床病理因素的关系1.通过免疫组化染色法对肝癌组织标本进行染色,检测标本组织中OPN的表达;2.用Fisher精确概率检验或者卡方检验比较OPN的表达与临床病理因素之间的相关性;3.用Western bolt方法检测OPN在HBV阳性与HBV阴性患者肝癌组织中的表达。第二部分HBV病毒及其编码的HBx蛋白调节OPN表达的研究1.采用HepG2.2.15细胞系(稳定整合HBV基因组并稳定表达乙肝病毒蛋白的HepG2细胞系)和Hep G2细胞系,观察HBV感染对OPN表达情况的影响;2.采用携带HBx的慢病毒感染HepG2细胞,观察HBx过表达对OPN表达情况的影响。第三部分HBx增强肝癌细胞干性的研究1.采用慢病毒介导的基因转染在Hep G2细胞株中过表达HBx,实时定量PCR检测干细胞表面标志物及干性相关转录因子的m RNA水平;2.流式细胞术检测干细胞表面标志物CD44、EpCAM阳性细胞数量,观察过表达HBx对肝癌细胞干性的影响;3.细胞侵袭实验观察过表达HBx对肝癌细胞侵袭性的影响。主要研究结果:第一部分1.HBV感染阳性的HCC患者其OPN表达明显高于HBV阴性的HCC患者(Fisher检验,P<0.05),且病毒复制量越高,OPN阳性表达越高(卡方检验,P<0.05);2.OPN的表达与肿瘤分期显著相关,OPN阳性表达越高,肿瘤分期越高(卡方检验,P<0.05)。第二部分1.HepG2.2.15细胞中OPN的mRNA和蛋白质表达水平均较HepG2细胞中的水平显著增加(P<0.01);2.HepG2细胞中过表达HBx显著上调OPN基因及蛋白表达的水平(P<0.01)第三部分1.实时定量PCR检测,在过表达HBx的HepG2(Hep G2-lenti-HBx)组中,其干细胞表面标志物及干性相关转录因子的m RNA水平均显著高于对照组空载体慢病毒感染的Hep G2细胞(Hep G2-lenti)水平(P<0.01);2.HepG2-lenti-HBx细胞中CD44、Ep CAM阳性的细胞数量均明显高于对照组慢病毒感染的HepG2细胞(Hep G2-lenti)水平(P<0.01)。3.Hep G2-lenti-HBx细胞侵袭性较Hep G2细胞(Hep G2-lenti)增强(P<0.01)。结论:HBx能够显著上调OPN的表达,增强肝癌细胞的干性,并能增强肝癌细胞的侵袭;而OPN的表达也与HBV的复制量、肝癌的分期相关。因此,结合既往研究,提示HBx介导的OPN表达上调可能增强肝癌细胞的干性,并且在HBV相关肝癌患者的预后不良中起着关键的作用。