一、研究背景和目的登革病毒(dengue virus, DEN)属黄病毒科黄病毒属,为单股正链RNA病毒,体积较小,约45-55nm,依抗原性不同分为四个血清型[1,2]。登革病毒主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊等媒介昆虫传播,引起登革热以及发病率和死亡率很高的登革出血热和登革休克综合征。登革病毒病流行于热带和亚热带地区,每年约有5000万至1亿人感染,是一种分布广、发病多、危害较大的人类传染病,已成为全球公共卫生关注的焦点之一[3]。登革热的诊断目前主要依赖病毒分离培养以及血清中特异性IgM、IgG抗体测定,血清学诊断由于登革抗体与其他黄病毒存在交叉反应,故存在一定的局限性[4]；病毒的分离鉴定,由于费时费力,技术要求高,不适合临床使用。分子生物学检测技术的发展,为登革热的早期诊断提供了可能,应用普通RT-PCR方法可在1天内进行登革病毒的鉴定和分型诊断,但该方法易造成标本间的交叉污染而得到假阳性结果。TaqMan实时荧光定量PCR技术,相对于常规的PCR技术而言,具有更高的敏感性、特异性和重复性。而且还具有快速、高通量、污染少等特点。本研究欲建立更省时、特异,可对登革1型病毒进行早期诊断的实时荧光定量PCR方法。随着分子生物学技术的飞速发展,实时荧光定量PCR技术在生物学研究中的应用越来越广泛。实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它在常规PCR基础上添加了荧光染料或荧光探针。荧光染料能特异性掺入DNA双链,发出荧光信号,而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。荧光探针法是将荧光共振能量传递技术应用于常规PCR中,在探针的5,端标记一个荧光报告基团(R),3,端标记一个淬灭基团(Q),两者可构成能量传递结构,即5,端荧光基团所发出的荧光可被淬灭基团吸收或抑制；当两者距离较远时,抑制作用消失,报告基团荧光信号增强,荧光监测系统可接收到荧光信号。利用以上荧光产生原理,在PCR过程中可以连续不断地检测反应体系中荧光信号的变化。当信号增强到某一域值(PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,域值的缺省设置为3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍)时,Ct值被记录下来。C代表Cycle,t代表threshold,Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。在这一技术的发展过程中,两个重要的发现起着关键的作用[5]：①在20世纪90年代早期,TaqDNA多聚酶的5,核酸外切酶活性的发现,它能降解特异性荧光标记探针,因此使得间接地检测PCR产物成为可能。②此后荧光双标记探针的运用使得在一个密闭的反应管中实时地监测反应全过程成为可能。这两个发现的结合以及相应的仪器和试剂的商品化发展导致实时荧光定量PCR技术在研究工作中的广泛运用。1996年,美国应用生物系统公司(AppliedBiosystems, ABI)的ABIPrism7700和5700、罗氏公司(Roehe)的LightCyclerTM等仪器率先投入商业使用。它们的扩增和检测全部自动化、耗时短、工作效率高。国内使用较多的有ABI Prism7000、7900、7700型和LightCylerTM等。ABIPrism7900等RQ-PCR仪可用于高通量(384孔板)检测,而ABIPriSm7000则利用了多色多通道技术。目前最常用的实时荧光定量PCR产物的检测技术都是应用荧光染料或基团,并将PCR与实时信号检测相结合,其中最简单的是双链DNA嵌合荧光染料技术,该法成本低廉,但SYBRGreen荧光染料能与所有的DNA双链相结合,特异性不如TaqMan探针法。要想用荧光染料法得到比较好的定量结果,对PCR引物设计的特异性和PCR反应的质量要求就比较高。而TaqMan探针法则是高度特异的定量PCR技术,其核心是利用Taq酶的3,-5,外切核酸酶活性,切断探针,产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合,所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。随着研究的深入及试剂的商品化,又发展衍生出更多的荧光定量PCR检测技术,如TaqMan MGB法、Molecular Beacon法、Amplisensor、Light cycler、complex probes等。二、研究方法1、引物探针设计及标准曲线建立：从GenBank中下载八十株不同年份和不同地区的登革1型病毒基因组全序列,登革2、3、4型病毒以及黄病毒属其它病毒也各下载十株,寻找保守序列,使用BeaconDesigner7.0软件设计引物探针。将含有保守序列的质粒经过10倍系列稀释后,进行荧光定量PCR反应得到相应的扩增曲线和标准曲线。2、荧光定量PCR特异性、重复性、再现性、敏感性实验：用建立的荧光定量PCR方法对登革1-4型病毒标准株以及乙型脑炎减毒活疫苗株进行检测。线性化后的质粒10倍倍比稀释6个浓度,从1.01×107稀释到1.01×102copies/μl,分不同的时间重复三次,每次做三个重复孔,验证重复性和再现性。此外,对PMDns2a质粒进行10倍倍比稀释,荧光定量PCR检测比较其敏感性,将扩增片段反转录为RNA,进行倍比稀释做敏感性检测。3、临床标本检测：对广州市第八人民医院提供的cDNA,以及对东莞疑似病人血清提取RNA并反转录的cDNA,进行荧光定量PCR检测,用登革病毒总引物探针进行验证,并且根据Ct值对荧光定量PCR方法以及常规PCR方法进行比较。三、研究结果1、标准曲线建立：得到标准曲线相关系数R2=0.999,扩增效率Eff=96.5%,回归方程Y=-3.410logX+34.87(Y为Ct值,X为模板浓度),并且对Ct值和模板浓度的对数值进行相关与回归分析,直线相关系数r=-1.000,P=0.000,回归系数为-3.410,P=0.000,从中可以看出,所作的标准曲线的Ct值与初始浓度有较好的线性关系。2、特异性：采用本方法对登革1型病毒提取核酸的扩增结果为阳性,而对其它三型登革病毒以及乙型脑炎病毒提取核酸的扩增结果均显示为阴性,表明所建立的针对登革1型病毒的荧光定量PCR方法不会受到其它三型登革病毒以及乙型脑炎病毒干扰。3、重复性和再现性：重复性标准差(SDr)在0.04与0.44之间,再现性标准差(SDR)在0.14与0.29之间,变异系数<2%,并且通过析因方差分析得浓度和时间之间不存在交互效应(F=0.691,P=0.726),不同稀释浓度之间的Ct值有差异(F=10528.497,P=0.000)；三个重复时间之间并无差异(F=0.451,P=0.641)。说明建立的方法具有良好的重复性和再现性。4、敏感性：用本研究建立的荧光定量PCR方法检测质粒,敏感性可达到1copy/μl。用RNA进行敏感性检测,可达102copies/μl。并且对Ct值和RNA浓度的对数值进行相关与回归分析,直线相关系数r=-1.000,P=0.000,回归系数为-3.305,P=0.000,认为Ct值与RNA浓度的对数值直接存在直线回归关系,得回归方程Y=-3.3051ogX+39.727(Y为Ct值,X为RNA浓度)。5、临床标本检测：对广州市第八人民医院提供的cDNA样本以及东莞疑似病人血清进行检测。采用本研究所建立的登革1型病毒型特异引物探针进行荧光定量PCR检测,对本方法以及常规PCR方法进行配对计数资料的卡方检验(χ2检验),P=0.000,表明两种检测方法有统计学差异,而本研究方法阳性率明显高于常规PCR方法,表明本研究方法优于常规PCR。四、结论本研究成功设计了针对登革1型病毒的型特异性引物和探针,可实现对临床疑似病例的早期快速检测和鉴别诊断,具有快速、敏感、特异、重复性好的特点,并可对标本中病毒进行定量。