【摘 要】
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目的:前期研究表明,天然来源活性成分杜鹃素可有效抑制球囊损伤所致的大鼠颈总动脉内膜增生,该作用部分归因于其抑制血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）增殖的特性,葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78,Grp78）是杜鹃素直接结合蛋白之一,但该化合物是否经靶向结合Grp78抑制VSMCs增殖及其潜在作用机制尚不明确
【基金项目】
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山西省自然科学基金“具有Grp78ATP酶结构域结合特性的DJSs靶向结合Grp78抑制VSMC异常增殖作用机制研究（编号:20210302123318）”； 基于炎性反应的重大疾病创新药物山西省重点实验室开放基金“Grp78靶向亲和小分子FDBP抑制VSMC过度炎症反应作用机制研究（No.2021sxcxyw08）；
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目的:前期研究表明,天然来源活性成分杜鹃素可有效抑制球囊损伤所致的大鼠颈总动脉内膜增生,该作用部分归因于其抑制血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells,VSMCs）增殖的特性,葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78,Grp78）是杜鹃素直接结合蛋白之一,但该化合物是否经靶向结合Grp78抑制VSMCs增殖及其潜在作用机制尚不明确。本文拟采用分子生物学、生物信息学等综合手段,在蛋白-细胞层面逐步确证杜鹃素靶向结合Grp78蛋白调节VSMCs表型（增殖、迁移及炎症等）转换的作用及其机制,为以杜鹃素为先导化合物设计合成高活性新结构衍生物提供明确的靶标,为杜鹃素类化合物防治内膜增生性血管疾病提供理论依据和数据支撑。方法:1.联用细胞热转变分析（cellular thermal shift assay,CETSA）、蛋白印迹法（western blotting,WB）、分子对接技术及ATP酶活性检测等综合手段,检测杜鹃素与Grp78蛋白的直接结合特性,考察其对Grp78功能的影响。2.借助STRING数据库、GO功能富集分析和KEGG通路富集分析等生物信息学手段,预测杜鹃素抑制血管内膜增生（intimal hyperplasia,IH）作用的靶蛋白,分析其调控的关键信号通路,预测Grp78与该通路间的关联。3.利用CCK8、Ed U插入染色、划痕试验、酶联免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）、流式细胞术、WB和si RNA转染等方法,考察杜鹃素及Grp78 si RNA对A7r5细胞增殖、迁移和炎症等表型的影响,检测二者单独作用和联合作用对Grp78及PI3K/Akt/m TOR信号通路关键蛋白活化或表达的调控作用。结果:1.CETSA实验结果显示,杜鹃素(75μmol·L-1,150μmol·L-1,300μmol·L-1)可浓度依赖地提高人重组Grp78蛋白、细胞总蛋白和A7r5细胞中Grp78的热稳定性,分别从纯蛋白、总蛋白和细胞三个层面证明,杜鹃素可与Grp78直接结合;分子对接和ATP酶活性检测结果表明,杜鹃素可与Grp78的ATP酶结构域结合并抑制其ATP酶活性。2.GO功能富集分析结果显示,杜鹃素抑制IH的生物过程涉及蛋白激酶活性、蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶活性等;分子功能主要包括细胞凋亡过程的负调控、蛋白磷酸化等。KEGG信号通路富集分析得到43条（p＜0.05）信号通路,其中,PI3K/Akt/m TOR通路富集程度较高,提示该通路是杜鹃素抑制IH的关键信号通路之一。3.10%FBS诱导的A7r5细胞增殖模型中,杜鹃素和Grp78 si RNA单独作用均能抑制A7r5细胞增殖,将细胞阻滞于G0/G1期,抑制A7r5细胞迁移;可抑制10%FBS诱导Grp78表达及PI3K/Akt/m TOR通路的活化。二者联用强于单独作用的效果。4.H2O2诱导的A7r5细胞炎症模型中,杜鹃素和Grp78 si RNA单独作用均可抑制细胞炎症因子IL-1β和TNF-α的分泌,逆转m TOR的表达;二者的联合作用强于各自单独作用的效果;杜鹃素可逆转H2O2诱导的A7r5细胞p-Akt的下调,而Grp78si RNA无此作用。结论:杜鹃素经靶向结合于Grp78的ATP酶结构域,调控PI3K/Akt/m TOR信号通路轴,抑制VSMC增殖和迁移,调控m TOR信号通路抑制炎症表型,多角度抑制血管内膜增生;本研究确证Grp78是杜鹃素抑制VSMC增殖和炎症表型的直接作用靶蛋白。
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