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目的:研究激活G蛋白偶联受体1(TGR5)对高糖诱导的乳小鼠心肌细胞炎症因子表达的影响,并探讨可能存在的机制。方法:实验一:1、乳小鼠心肌细胞的培养与鉴定:使用两步酶消化及差速贴壁法培养心肌细胞,免疫荧光法鉴定心肌细胞。2、检测病毒对心肌细胞的感染效率:(1)对照组:培养基;培养基+Poly brene溶液;(2)实验组:培养基+TGR5 shRNA;培养基+TGR5 shRNA+Poly brene溶液,其中TGR5 shRNA具有沉默TGR5基因表达的作用,Polybrene为病毒感染增强液。每一组设置MOI=5、25、50、100、150五个亚组,每组设置3个复孔(MOI=病毒数量/细胞数量总数)3、RT-PCR及Western Blot法检测乳小鼠心肌细胞TGR5 mRNA及蛋白表达量,分离新生乳小鼠心肌细胞,正常培养基孵育48h贴壁,进行实验分组:(1)正常对照组:正常培养基孵育48h;(2)TGR5 shRNA组:加入含TGR5 shRNA病毒的正常培养基孵育4~6h后加入同等体积的正常培养基孵育16h,更换无病毒培养基再孵育24h。4、分离乳小鼠心肌细胞正常培养基培养48h,用0、1、10、20、30、50、100umol/L不同浓度的INT-777干预后,MTT法测定心肌细胞活性,确定TGR5特异性激动剂INT-777对心肌细胞作用的有效浓度。实验二:激活TGR5对心肌细胞中HG诱导的炎症因子表达和NF-κB信号活化的影响1、观察高糖(High glucose,HG)作用不同时间对心肌细胞IL-1β、IL-6、TNF-α表达的影响,设置0、1、2、4、8、16、24h不同的HG作用时间,采用RT-PCR法测定心肌细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的相对表达量。2、观察高糖(High glucose,HG)作用不同时间对心肌细胞p-IκBα/NF-κB信号通路的影响,分离培养乳小鼠心肌细胞,48h贴壁后,设0、1、2、3、6、12、24h不同的HG作用时间,采用Western Blot法测定心肌细胞p-IκBα/NF-κB的相对表达量。3、观察激活TGR5后对HG诱导的乳小鼠心肌细胞p-IκBα/NF-κB信号通路的影响,实验分组如下:(1)正常对照组;(2)HG;(3)HG+INT-777(TGR5特异性激动剂);(4)HG+INT-777+TGR5 shRNA;(5)HG+INT-777+SQ22536(cAMP抑制剂),采用Western Blot法测定p-IκBα/NF-κB蛋白的相对表达量。4、检测激活TGR5后对HG诱导的乳小鼠心肌细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达的影响,分离乳小鼠心肌细胞正常培养基孵育48h,贴壁后进行分组实验,分组如下:(1)正常对照组;(2)HG;(3)HG+INT-777;(4)HG+INT-777+TGR5 shRNA;(5)HG+INT-777+SQ22536;(6)HG+JSH-23(NF-κB抑制剂),采用RT-PCR法测定IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的相对表达量。实验三:激活TGR5后对HG诱导的乳小鼠心肌细胞炎症因子表达及MAPKs信号活化的影响1、观察高糖(High glucose,HG)作用不同时间对心肌细胞MAPKs信号活化的影响,分离培养乳小鼠心肌细胞,48h贴壁后,设0、1、2、3、6、12、24h不同的HG作用时间,采用Western Blot法测定心肌细胞MAPKs的相对表达量。2、观察激活TGR5后对HG诱导的乳小鼠心肌细胞MAPKs信号的影响,实验分组如下:(1)正常对照组;(2)HG;(3)HG+INT-777;(4)HG+INT-777+TGR5 shRNA;(5)HG+INT-777+SQ22536,Western Blot法测p-ERK、p-JNK、p-P38蛋白的相对表达量。3、检测激活TGR5后对HG诱导的乳小鼠心肌细胞炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达的影响,分离乳小鼠心肌细胞正常培养基孵育48h,心肌细胞贴壁后进行分组实验,实验分组如下:(1)正常对照组;(2)HG;(3)HG+INT-777;(4)HG+PD98059(JNK抑制剂);(5)HG+SP600125(ERK抑制剂),采用RT-PCR法测定IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的相对表达量。结果:实验一:1、心肌细胞培养成功,荧光免疫法检测心肌细胞纯度大于90%。2、荧光显微镜下观察TGR5 shRNA病毒感染心肌细胞效率,选定MOI=100进行后续实验。TGR5基因沉默后实验结果显示,与正常组比较,TGR5shRNA组TGR5蛋白及mRNA表达量明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。3、观察不同浓度TGR5特异性激动剂INT-777对心肌细胞生长的影响实验结果显示:在正常培养的乳小鼠原代心肌细胞中,1-50umol/L浓度的INT-777对心肌细胞的生长有不同程度的影响,但均未出现细胞毒性。与正常对照组比较,其中100umol/L显著抑制了心肌细胞的生长(P<0.05)。根据文献及本实验结果选择30umol/L作为后续实验浓度。实验二:激活TGR5对心肌细胞中HG诱导的炎症因子表达和NF-κB信号活化的影响1、观察高糖(High glucose,HG)作用不同时间对心肌细胞IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达实验结果显示:与正常组比较,HG作用不同时间对心肌细胞各种炎症因子表达的影响有明显时间差异性,IL-1β、IL-6在HG作用8h、TNF-α在HG作用2h时表达显著增高,选择上述时间进行后续实验。2、观察HG作用不同时间对心肌细胞p-IκBα/NF-κB信号通路影响实验结果显示:与正常组比较,HG作用不同时间对心肌细胞IκBα、NF-κB信号活化的的影响有明显时间差异性,p-IκB-α、NF-κB在HG作用6h时表达显著增高,选作为后续实验作用时间。3、激活TGR5后对HG诱导的心肌细胞NF-κB、IκBα信号活化影响结果如下:(1)与正常组比较,HG、HG+INT-777+TGR5 shRNA、HG+INT-777+SQ22536组p-IκBα、NF-κB的蛋白表达量明显增加(P<0.05),HG+INT-777组p-IκBα、NF-κB的蛋白表达量明显减少(P<0.05)。(2)与HG组比较,HG+INT-777组p-IκBα、NF-κB的蛋白表达量明显减少(P<0.05),HG+INT-777+TGR5 shRNA组p-IκBα、NF-κB的蛋白表达量明显增加(P<0.05),HG+INT-777+SQ22536组NF-κB的蛋白表达量明显增加(P<0.05),而HG+INT-777+SQ22536组p-IκBα的蛋白表达量无明显差异(P>0.05)。(3)与HG+INT-777组比较,HG+INT-777+TGR5shRNA、HG+INT-777+SQ22536组p-IκBα、NF-κB的蛋白表达量明显增加(P<0.05)。实验结果提示TGR5特异性激动剂INT-777激活TGR5后可能通过增加cAMP减少HG诱导的心肌细胞p-IκBα/NF-κB的表达。4、激活TGR5后对HG诱导的心肌细胞各炎症因子表达影响。结果如下:(1)与正常组比较,HG、HG+INT-777+TGR5 shRNA、HG+INT-777+SQ22536组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达明显升高,有统计学意义(P<0.05);HG+INT-777组IL-1β、IL-6 mRNA表达无明显差异(P>0.05)、TNF-αmRNA表达量增加(P<0.05);HG+JSH-23组IL-1β、TNF-αmRNA表达无明显差异(P>0.05),HG+JSH-23组IL-6 mRNA表达升高,有统计学意义(P<0.05)。(2)与HG组比较,HG+INT-777、HG+JSH-23组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达降低,有统计学意义(P<0.05),HG+INT-777+TGR5 shRNA组IL-1β、TNF-αmRNA无明显差异(P>0.05),HG+INT-777+TGR5 shRNA IL-6 mRNA表达量明显升高(P<0.05);HG+INT-777+SQ22536 IL-1βmRNA表达降低、HG+INT-777+SQ22536组IL-6 mRNA表达量明显升高(P<0.05)、HG+INT-777+SQ22536组TNF-αmRNA无明显变化(P>0.05)。(3)与HG+INT-777组比较,HG+INT-777+TGR5shRNA、HG+INT-777+SQ22536组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达量明显升高(P<0.05);HG+JSH-23组IL-1βmRNA表达无明显差异(P>0.05)IL-6mRNA升高,有统计学意义(P<0.05)、TNF-αmRNA表达降低,有统计学意义(P<0.05)。实验结果表明:TGR5特异性激动剂INT-777激活TGR5后可能通过抑制NF-κB信号活化减少HG诱导的心肌细胞IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA的表达。MAPKs信号活化的影响1、观察HG对心肌细胞MAPKs信号活化的影响结果显示:与正常组比较,HG作用不同时间对心肌细胞p-JNK、p-ERK、p-P38(MAPKs)信号活化的影响有明显时间差异性,p-ERK、p-P38在HG作用1h时,p-JNK在HG作用2h时表达显著增高,选作后续实验作用时间。2、激活TGR5后对HG诱导的心肌细胞p-JNK、p-ERK、p-P38(MAPKs)信号活化影响。实验结果如下:(1)与正常组比较,HG、HG+INT-777+TGR5 shRNA、HG+INT-777+SQ22536组p-JNK、p-ERK、p-P38的蛋白表达量明显增加(P<0.05),HG+INT-777组p-JNK、p-ERK的蛋白表达量无明显差异(P>0.05),而p-P38蛋白表达量明显增加(P<0.05);(2)与HG组比较,HG+INT-777组p-JNK、p-ERK的蛋白表达量明显减少(P<0.05),而p-P38蛋白表达量明显增加(P<0.05),HG+INT-777+TGR5 shRNA组p-ERK、蛋白表达量减少(P<0.05),p-P38的表达量增加(P<0.05)、p-JNK无明显差异(P>0.05),HG+INT-777+SQ22536组p-ERK、p-JNK蛋白表达量减少(P<0.05),p-P38的表达量增加(<0.05);(3)与HG+INT-777组比较,HG+INT-777+TGR5 shRNA、HG+INT-777+SQ22536组p-JNK、p-ERK的蛋白表达量明显增加(P<0.05),而p-P38的表达量无明显差异(P>0.05)。结果提示TGR5特异性激动剂INT-777激活TGR5后可能通过增加cAMP减少HG诱导的心肌细胞p-ERK和p-JNK(MAPKs)表达。3、激活TGR5后对HG诱导的心肌细胞各炎症因子表达影响结果如下:与正常组比较,HG组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达量HG组明显实验三:激活TGR5后对HG诱导的乳小鼠心肌细胞炎症因子表达及增加,有统计学意义(P<0.05),HG+PD98059、HG+SP600125、HG+INT-777组IL-1βmRNA表达量明显增加(P<0.05)、IL-6与TNF-αmRNA的表达无明显差异(P>0.05);与HG组比较,HG+INT-777、HG+PD98059、HG+SP600125组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达明显减少,有统计学意义(P<0.05);与HG+INT-777组比较,HG+PD98059、HG+SP600125组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达无明显差异(P>0.05)。结果提示:TGR5特异性激动剂INT-777激活TGR5后可能通过抑制ERK、JNK通路减少HG诱导的心肌细胞IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达。结论:1、高糖通过NF-κB、ERK及JNK通路诱导心肌细胞炎症因子的表达。2、激活TGR5能减少高糖诱导的心肌细胞中炎症因子的表达。3、激活TGR5可能通过抑制NF-κB、ERK及JNK信号通路减少高糖诱导的心肌细胞炎症因子的表达。