旋毛虫病是世界范围内一种重要的食源性寄生虫病。旋毛虫分泌的丝氨酸蛋白酶抑制剂在幼虫发育过程中发挥着关键的作用。丝氨酸蛋白酶抑制剂也是早期宿主免疫反应的靶分子抗原,可以作为新的抗原用于旋毛虫感染的早期诊断。本研究应用dsRNA干扰技术沉默旋毛虫Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的表达,进一步从体外存活、侵入肠上皮细胞情况、体内发育情况、雌虫生殖力以及对宿主免疫的影响几个方面进行分析,从而为研究Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因功能奠定基础。本研究通过浸泡和电转两种方法将特异性dsRNA-TsKaSPI导入旋毛虫肌幼虫和成虫体内,而后应用实时荧光定量PCR检测肌幼虫和成虫TsKaSPI基因转录水平,Western-blot检测肌幼虫TsKaSPI基因蛋白水平。结果表明,肌幼虫和成虫该基因转录水平与对照组相比,浸泡法降低了59.36%、67.80%(P<0.001),电转法降低了63.36%,68.91%(P<0.001);肌幼虫该蛋白表达水平与对照组相比,浸泡法和电转法分别降低70.67%、69.24%(P<0.001);电转法沉默效率优于浸泡法,dsRNA-TsKaSPI最优干扰浓度为30μg/ml。同时设计一条Tsp03044基因实时荧光引物,用来验证dsRNA干扰的特异性。结果表明,TsKaSPI基因转录水平与对照基因Tsp03044相比明显降低,即dsRNA-TsKaSPI只能引起与它同源基因的沉默。随后研究dsRNA-TsKaSPI经浸泡和电转两种方法处理后,体外连续培养6d观察每1d转录水平的变化。结果表明,浸泡法在培养第1d转录水平有所降低,随后在第3d转录水平与对照组相比显著降低了63.21%(P<0.001),达到最好的沉默效果,随着天数增加,转录水平逐渐恢复,而电转法在培养第1d转录水平与对照组相比显著降低了69.31%(P<0.001),沉默效果最佳,第2d和第3d仍处于较低的水平,随后几天逐渐恢复,由此推出电转法转染效率优于浸泡法。体外培养观察TsKaSPI基因沉默对肌幼虫体外存活、体外侵入肠上皮细胞影响。结果表明,浸泡法与电转法分别处理肌幼虫后体外连续培养6d,浸泡法存活率为96%、91%、87%、67%、55%、46%(P>0.05),电转法存活率为96%、91%、82%、67%、61%、52%(P>0.05),与对照组相比无显著性差异,推测,TsKaSPI基因对旋毛虫体外存活方面未产生影响。体外侵染肠上皮细胞结果表明,TsKaSPI处理组与对照组相比,作用5h时浸泡法与电转法侵入率分别为41%、43%,明显低于对照组,同时随着培养时间增加,侵入肌幼虫的数量逐渐增多,在第5h时入侵率达到最佳。推测,TsKaSPI基因沉默后对肌幼虫体外侵入肠上皮细胞有一定的抑制作用。将dsRNA导入后的肌幼虫经口接种小鼠,观察TsKaSPI基因沉默对肌幼虫体内发育的影响。结果表明,6d肠道成虫和35d肌幼虫的减虫率与对照组相比分别为36.22%和31.87%,同时发现雌虫PBS组、e GFP对照组和TsKaSPI的处理组新生幼虫量分别为49.20±5.93、49.40±4.62、50.80±4.32(P>0.05),处理组与对照组相比雌虫新生幼虫数没有明显的差异,推测,TsKaSPI基因与肌幼虫在宿主体内发育方面有重要的影响,而与雌虫生殖力关系不大。本研究通过检测小鼠脾淋巴细胞CD4~+CD8~+细胞数以及血清中抗体水平,进一步分析了TsKaSPI基因沉默后对宿主免疫方面的影响。流式细胞术(FCM)检测结果显示,TsKaSPI处理组CD3+CD4~+、CD3+CD8~+细胞数与PBS对照组相比明显增加,CD4~+/CD8~+比值也明显上升。同时,ELISA检测结果显示,TsKaSPI处理组IgG1、IgG2a、IgM抗体水平与对照组相比明显降低,IgG1/IgG2a比值也显著降低。因此,我们初步认为TsKaSPI基因的沉默诱导宿主Th1型细胞免疫反应增强,引起Th2型体液免疫减弱。综上所述,本研究证实dsRNA可明显抑制Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的转录和表达、肌幼虫对肠上皮细胞的侵入及幼虫在小鼠体内发育,同时促进Th1型细胞免疫应答,使Th2型体液免疫效应减弱。说明Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂不仅在旋毛虫侵入宿主肠粘膜及发育过程中起着非常重要的作用,而且在与宿主免疫的相互作用中也发挥着非常重要的作用,为进一步研究旋毛虫基因功能打下了坚实基础。