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【目的】
1．检测p16，eIF<,4>E，cIAP1，Dab2，FHIT,cFLIP等基因在宫颈癌中有否扩增或丢失，找出与宫颈癌发生发展相关的分子标志。
2．检测CDK4在宫颈癌发生发展中的蛋白表达情况，探讨CDK4在宫颈癌发生发展过程中的意义及作用。
3．探讨多重连接探针扩增法(MLPA，Multiplex ligation dependent probeamplification)，以期在本实验室建立起这一新技术。
注：本实验中所用宫颈癌标本均为宫颈鳞癌，在文中均简称宫颈癌。
【方法】
1．显微切割及DNA提取
从新鲜宫颈癌标本(2004年10月开始收集，于-80℃冰箱保存)和2004年的宫颈癌石蜡标本中，筛选出15例进行显微切割和DNA提取。
新鲜标本做冰冻切片，石蜡标本切片并脱蜡，均用苏木素轻染色，在倒置显微镜下找准正常组织(间质)和癌组织的部位，进行显微切割，分别取正常组织和癌细胞群，用商用试剂盒提取DNA。
2．PCR 扩增靶基因
检测的6个靶基因是p16(MTS1，多肿瘤抑制基因1)、eIF4E(真核细胞翻译起始因子4E)、cIAP1(一种凋亡抑制因子)、Dab2(分裂原反应性磷酸化蛋白基因)、FHIT(脆性组氨酸三联基因)、cFLIP(细胞型Fas相关死亡区域蛋白样β白介素-1 转换酶抑制蛋白基因，是一种凋亡抑制因子)。以各靶基因或靶基因的一个外显子为模板设计引物，进行PCR扩增检测。
3．扫描分析，确定基因扩增或丢失
运用bandscan 4.3对PCR扩增产物的电泳条带进行灰度扫描，并用软件SPSS 13.0对数据进行处理，确定发生扩增或丢失的基因或外显子。
4．免疫组化检测CDK4的表达
运用免疫组化SP法检测宫颈病变中CDK4的表达情况。检测对象为2004年全年的宫颈石蜡标本，包括19例慢性宫颈炎，15例低级别鳞状上皮内变(LSIL，包括 CIN Ⅰ)，41 例高级别鳞状上皮内病变(HSIL，包括CINⅡ，CINⅢ)，66例宫颈癌(squamous carcinoma of the cervix，SCC)。
5．MLPA方法学的建立
根据p16第2个外显子序列设计两条探针，每条探针包括两段序列。一段与母板 DNA p16 第二外显子序列互补，两探针中的这一段可前后相邻(没有碱基空隙)地结合到模板上；另一段根据M13噬菌体序列所设计，不能结合到模板DNA上，仅作为PCR通用引物的结合依据。在实验中，先使两条探针与正常组织(血样)DNA结合后，用DNA连接酶(T4 DNALigase,Ampligase Thermostale DNA Ligase，Taq DNA 连接酶)在合适条件下将两探针连接，连接成线的探针数量代表p16基因拷贝数量；之后用连接产物做PCR反应模板，进行PCR扩增和检测。
【结果】
1．癌组织的基因拷贝异常
在宫颈癌中，p16 exon1、eIF4E、cIAP1、Dab2均有不同程度的扩增，癌组织和正常组织中p16 exon1的拷贝数有差别，该基因在癌组织中的拷贝数较正常组织中的拷贝数明显增加，二者相比差异有统计学意义(P<0.05)。eIF4E，clAP1 和 Dab2 在宫颈癌中的基因拷贝异常情况均与p16 exon1相同(P<0.05)。FHIT exon10和cFLIP则无明显缺失或扩增(P>0.05)。
2．CDK4 在宫颈癌及其前期病变中的表达升高
按照慢性宫颈炎、LSIL、HSIL、宫颈癌的顺序，CDK4 的阳性表达率分别是21.1％(4/19例)、46.7％(7/15例)、73.2％(30/41例)、92.4％(61/66例)。各组CDK4阳性表达率与宫颈癌组CDK4阳性表达率的差异均具有极显著性意义(P<0.01)。宫颈炎组与LSIL组、LSIL组与HSIL组相比较差异均没有统计学意义(P>0.05)。因宫颈炎与LSIL绝大多数都可治愈，病变严重程度相似，故可将宫颈炎组与LSIL组合为一组，与HSIL组进行双侧X<'2>检验，结果显示CDK4 的阳性表达率的差异亦具有极显著性意义(P<0.01)。
3．MLPA 实验
以人的DNA做母板的情况下，T4 DNA Ligase 可将两条探针连接起来，用Ampligase Thermostale DNA Ligase和Taq DNA 连接酶则不能将其连接。但在不用人的DNA做母板的情况下(用鱼精DNA)，或不加母板的情况下(用水来补足连接体系)，用T4 DNA Ligase 仍可将这两条探针连接起来。
【结论】
1．p16 exon1在宫颈癌中的基因改变为扩增，这可以从另外一个角度解释在宫颈癌中p16蛋白表达增加的机制。本实验的结果从基因结构的改变方面表明了p16可能可以作为宫颈癌发生发展的有用的分子标志。
2．eIF4E、cIAP1、Dab2在宫颈癌中表现为扩增，可以初步考虑把这3个基因作为宫颈癌发生发展过程中的分子标志。
3．FHIT exon10、cFLIP在宫颈癌中无明显异常变化，提示FHIT exon10与cFLIP 基因可能与宫颈癌的发生发展关系不大。
4．CDK4蛋白在宫颈癌及宫颈癌前病变细胞中过表达，且CDK4的表达有随宫颈癌的发生发展而逐渐增高的趋势，说明CDK4可能促进宫颈癌的发生发展，并提示CDK4可能是宫颈癌发生发展过程中的一个较好的辅助诊断标记。
5．在MLPA实验中，用T4 DNA Ligase 可将两条探针连接起来。但母板存在与否，T4 DNA Ligase都可使两条探针连接，表明 T4 DNA Ligase 可使两条探针自连，实验暂不成功。