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结肠癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病率在全球范围内呈逐年上升趋势。我国东南沿海地区发病率相对较高,发病机制尚未完全明确,主要与环境因素和遗传因素有关。程序性细胞死亡(PCD)对于癌细胞的恶性增值至关重要。因此,了解程序性死亡的机制以及设计特定的诱导癌细胞死亡的治疗方案对疾病的治疗具有重要意义。程序性细胞死亡有两种,包括凋亡和自噬性死亡,二者具有不同的形态学特征。凋亡(I型PCD)是一种细胞自发的死亡机制,受多种细胞信号通路的调控。凋亡具有依赖caspase参与,细胞皱缩,染色质凝集,DNA降解和形成凋亡小体等特征。缺少凋亡性细胞死亡会导致自身免疫性疾病和肿瘤的发生,而过度的凋亡常常又与神经退行性疾病相联系。自噬性细胞死亡(II型PCD)是另一种重要的生物学细胞死亡方式,这种细胞死亡的主要特征是大量的细胞内含物降解,包括重要的细胞器如线粒体,被包裹进膜状的自噬体,然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体并进行降解。自噬在肿瘤的发展中具有重要的作用,癌细胞的自噬水平低于相对应的正常细胞。很多研究表明自噬与凋亡在一些情况下相互影响,甚至在有些情况下,二者受控于同一刺激物并产生不同的细胞反应。二者的相互作用取决于细胞环境和所受的刺激物,凋亡的发生有可能依赖于自噬的存在;其它一些情况下,自噬可能阻止凋亡的发生,抑制自噬可以提高细胞对凋亡信号的敏感性;也有一些情况下二者同时存在,但是相互独立的,抑制自噬活动可使细胞对死亡信号的反应从II型程序性细胞死亡转向I型。Bax和PUMA是关键的凋亡调控因子,缺失Bax和PUMA或者表达Bcl-2会抑制凋亡的发生,而这种凋亡性死亡的缺失会影响发育和促进肿瘤发生。因此在凋亡性死亡缺失的情况下,研究其它死亡方式的发生及其机制对癌症的治疗具有重要意义。近年来,随着对自噬多种功能研究的不断深入,自噬在人类疾病中的作用,包括神经退行性疾病、癌症、免疫和防御也逐步得到认同。在对自噬众多功能的研究中,其在细胞死亡和细胞生存中的作用是尤为重要和倍受争议的一个方面。传统的肿瘤治疗方案主要以凋亡为靶标,但是肿瘤发生过程中凋亡受抑已经是被广泛认知的重要事件。清除癌细胞不能仅仅通过凋亡性死亡,还可以通过其它死亡方式比如自噬性死亡来实现。当凋亡受抑时,如果我们能够激发自噬性死亡,这可能成为一种肿瘤治疗的新方案。本课题就此展开研究:第一部分,凋亡途径缺失对结肠癌细胞化疗敏感性的影响本部分实验使用5-FU(0,10,20,40μg/ml)处理结肠癌HCT116,HCT116 Bax-/-和HCT116 PUMA-/-细胞24小时,WST-8法和台盼蓝染色法检测细胞活力,发现5-FU可以明显抑制细胞生长,呈现剂量依赖性,且野生型细胞和凋亡缺失细胞在各剂量点具有相近的死亡率。收集处理细胞进行凋亡检测,发现野生型HCT116细胞的凋亡率显著高于缺失细胞,但凋亡缺失细胞具有相对较高的PI摄入,综合以上结果提示我们在缺失细胞中可能存在其它的死亡方式,比如自噬性死亡。第二部分,自噬性死亡在化疗药物处理凋亡缺失结肠癌细胞中的作用(一)5-FU处理凋亡缺失结肠癌细胞诱导了自噬的发生进而,我们对5-FU处理后的细胞进行自噬的相关检测,电镜检测结果显示,在缺失细胞中可见多个膜状囊泡包裹细胞内含物,说明存在自噬的发生,而在野生型细胞中无明显自噬泡出现,但有凋亡样细胞形态。为了进一步证实自噬的发生,我们采用GFP-LC3质粒转染HCT116,HCT116 Bax-/-和HCT116 PUMA-/-细胞,5-FU处理后进行荧光显微镜检测,在缺失细胞处理组中发现明显的散点状荧光分布,而野生型对应组为弥散样荧光分布。PI3K-Akt-mTOR是自噬发生的负调控机制,在癌细胞中,mTOR的抑制已被认为与自噬的发生紧密相连,它的关键下游底物是p70s6k。因此我们利用Western blot检测和比较野生型和凋亡缺失细胞中p70s6k的表达情况,结果发现凋亡缺失细胞中p70s6k的表达水平明显低于野生型细胞,表明凋亡缺失细胞中自噬性信号通路被激活。这些结果证实在5-FU处理的凋亡缺失细胞中存在自噬的发生。(二)抑制自噬降低凋亡缺失细胞对5-FU的敏感性自噬是一个高度保守的过程,而在一些特定的情况下,它也可以作为一种细胞死亡方式。在这部分实验中,我们使用3-MA (3-甲基腺嘌呤)作为自噬的抑制剂,电子显微镜下观察发现5-FU联合3-MA处理的细胞中只有很少或几乎没有自噬泡的出现;5-FU单独处理诱导的点状荧光分布在联合3-MA处理后也变为弥散样荧光分布。在相差显微镜下观察细胞形态的变化,台盼蓝染色法检测细胞死亡率,发现自噬抑制后缺失细胞死亡率降低,从而证实5-FU在凋亡缺失结肠癌HCT116细胞中诱导了自噬性死亡的发生,并作为替代的细胞死亡方式实现5-FU诱导的生长受抑。综上所述,本课题得出以下结论:1.化疗药物5-FU对野生型和凋亡缺失结肠癌细胞的生长抑制程度大体一致;2.化疗药物5-FU在凋亡缺失结肠癌细胞中诱导了自噬性死亡的发生,其作为替代的死亡方式介导凋亡缺失细胞对5-FU的敏感性。