研究背景及目的肝纤维化是指肝脏受到体内外多种损伤因素的作用时,细胞外基质(extracellular matrix,ECM)产生增多并发生沉积而导致的肝脏正常生理结构和功能被损坏的病理过程;是多种慢性肝病的共同病理过程,若得不到及时阻遏,肝脏内结缔组织持续增生,则可发展为预后极差的肝硬化甚至肝癌。但目前缺乏针对于肝纤维化诊疗的有效无创性手段,提示有必要对肝纤维化发生发展的分子机制进行深入研究。而肝星状细胞(hepatic stellated cell,HSC)作为肝纤维化发生时合成ECM的关键细胞,其由静止状态向活化状态转变而导致的胶原合成大于降解,是肝纤维化领域研究的重点,已有包括miRNA、lnc RNA在内的多种非编码RNA参与调控HSC生物学功能的改变。而同样作为非编码RNA的circRNA(circular RNA,环状RNA),不具有5’末端帽子和3’末端poly(A)尾巴,以共价键结合的方式形成环状结构而可稳定存在于真核细胞,并通过充当miRNA分子海绵、调控基因转录、编码多肽等方式在生物体内发挥重要的生物学功能。现有的研究发现circRNA在肿瘤、心肌细胞纤维化、特发性肺纤维化等多种疾病的发生中起重要的调控作用;大多数circRNA含有miRNA应答元件(miRNA response element,MRE),可作为内源竞争性RNA(competing endogenous RNA,ceRNA机制)与miRNA结合进而削弱其对下游靶基因的抑制作用;而在肝纤维化领域,亦有研究发现部分circRNA可通过影响HSC活化过程而参与该疾病的发生,这些都提示circRNA在HSC活化/肝纤维化的发生中的作用不容忽视。本课题以临床肝纤维化组织RNAseq测序结果为基础,对筛选出来的circRNAs进行分析验证,并选择circRNA＿1989为代表拟研究circRNA在HSC活化/肝纤维化发生中的作用,并初步探讨其靶向miR-185-3p/Col1a1的分子机制,为肝纤维化的研究提供新的分子靶点。主要从三部分进行研究:(1)肝纤维化进程中差异表达的环状RNA的筛选与验证;(2)体外实验探讨circRNA＿1989对HSC活化/肝纤维化发生的作用;(3)circRNA＿1989调控HSC活化/肝纤维化发生的ceRNA机制研究。第一部分:肝纤维化进程中差异表达的环状RNA的筛选与验证研究方法1.收集临床乙肝肝纤维化样本,对组织样本进行质检、HE染色,并参照Metavir半定量评估系统对肝纤维化组织进行病理学判读后进行RNAseq;对筛选出的差异表达circRNAs进行生物信息学分析,选择感兴趣的circRNAs拟行下一步研究;2.利用人重组TGF-β1细胞因子刺激LX-2使其激活,q RT-PCR检测肝纤维化指标α-SMA和Col1α1,及所筛选出的circRNAs在HSC活化/肝纤维化发生过程中的表达变化;3.选出以circRNA＿1989为代表的circRNA拟行进一步研究,通过circ Base、circbank等数据网站搜索和序列比对,得出其小鼠同源circRNA即mmu＿circ＿0001283;利用DMN构建小鼠肝纤维化模型,对肝组织进行HE染色及病理学鉴别后,通过q RT-PCR检测mmu＿circ＿0001283在小鼠肝纤维化形成进程中的表达变化。研究结果1.对6例肝纤维化组织样本(F1 2例,F2 2例,F3 1例,F4 1例)进行RNAseq测序分析,以数据库中正常肝脏组织为对照,筛选出在肝纤维化组织中存在2630个上调和1734个下调的circRNAs,作出差异表达基因聚类热图;并从中挑选出6个外显子来源的EcircRNAs和10个内含子来源的ci RNAs用于后续验证;2.经TGF-β1刺激后,LX-2中肝纤维化指标α-SMA和Col1α1表达分别升高了3.83倍和3.29倍,p<0.05;与此同时,成功验证了包括circRNA＿1989等在内的13个circRNAs在LX-2活化进程中的表达变化;并选择circRNA＿1989为代表作深入研究。3.DMN构建的肝纤维化小鼠,HE染色病理结果提示小鼠肝纤维化形成,q RT-PCR检测结果提示:相对于Blank组小鼠,DMN给药组小鼠肝组织中α-SMA和Col1α1表达量分别升高了8.12倍和4.73倍,p<0.05;而mmu＿circ＿0001283表达量升高了2.52倍,p<0.05。结论1.在HSC活化及肝纤维化发生过程中,存在多种circRNAs的差异性表达;2.circRNA＿1989在HSC活化及肝纤维化的发生进程中表达升高;第二部分:体外实验探讨circRNA＿1989对HSC活化/肝纤维化发生的作用研究方法1.根据circRNA＿1989序列信息,设计3条si RNA靶点,进行质粒构建与慢病毒包装,分组为NC,KD1,KD2,KD3;2.circRNA＿1989干扰慢病毒感染LX-2细胞株,q RT-PCR检测3个干扰靶点干扰效率,选出最佳干扰效率靶点;3.在LX-2中敲减circRNA＿1989后,CCK-8法连续检测5天即5个时间节点的细胞OD450值,以分析细胞增殖活化能力的改变;Annexin V-APC单染法结合流式细胞仪检测细胞是否发生凋亡;q RT-PCR和Western blot检测肝纤维化指标α-SMA和Col1α1表达的改变。研究结果1.成功构建circRNA＿1989干扰慢病毒,感染成功的LX-2细胞发出绿色荧光,荧光率可达80%左右;相对于NC组,KD1敲减效率为25.07%,KD2敲减效率为24.10%,KD3敲减效率可达72.27%,p<0.05;选择最佳干扰效率的KD3组行功能学实验;2.在LX-2中敲减circRNA＿1989后,CCK-8检测第2天,NC组与KD组的OD450值差异无显著性差异,p=0.23;至第3～5天,相对于NC组,KD组OD450值均减小,p<0.05;且相对于第1天,第2～5天KD组的OD450 fold均小于NC组,p<0.05。敲减circRNA＿1989后,LX-2主要发生晚期凋亡;且NC组凋亡细胞比例为(2.63±0.12)%,KD组凋亡细胞比例为(13.27±0.90)%;相对于NC组,KD组凋亡细胞比例升高了5.04倍,p<0.05;3.敲减cric RNA＿1989的LX-2中SMA和Col1a1在m RNA水平的表达量分别减少了81.87%和30.88%,p<0.05;Western blot结果提示α-SMA和Col1a1在蛋白水平的表达量均显著下降。结论成功构建circRNA＿1989 si RNA干扰靶点,并完成病毒包装和LX-2干扰稳定株的构建;在LX-2中敲减circRNA＿1989后,细胞增殖活力受到抑制,而凋亡细胞比例升高,同时细胞中肝纤维化指标α-SMA和Col1a1表达减少;提示circRNA＿1989可能通过促进HSC活化并抑制其凋亡的方式参与肝纤维化的发生。第三部分:circRNA＿1989调控HSC活化/肝纤维化发生的ceRNA机制研究研究方法1.生物信息学分析可能与circRNA＿1989存在结合位点的miRNA,并作出网状分析图谱;RNAseq筛选出肝纤维化组织中差异表达的miRNAs,得出差异基因聚类热图;二者结果取交集得出miR-185-3p可能为circRNA＿1989的靶向miRNA;2.q RT-PCR检测miR-185-3p在经TGF-β1刺激活化的LX-2及DMN构建的小鼠肝纤维化组织中的表达改变;通过Target Scan数据网站及双荧光素酶报告基因实验筛选并验证miR-185-3p可能的靶基因;在LX-2中转染miR-185-3p mimics/inhibitor,q RT-PCR及Western blot检测miR-185-3p对细胞中肝纤维化指标α-SMA和Col1a1表达的影响;3.利用circRNA＿1989与miR-185-3p位点结合信息,构建结合序列质粒(结合位点GACCA)、互补序列质粒(突变为互补序列CTGGT)及突变序列质粒(突变为GCAAG),通过双荧光素酶报告基因实验验证二者的靶向结合关系;q RT-PCR检测敲减circRNA＿1989后miR-185-3p的表达变化;将miR-185-3p上调、下调后,检测circRNA＿1989表达量的改变。研究结果1.生物信息学分析可知circRNA＿1989可能与miR-185-3p、miR-1225、miR-484等miRNA存在结合位点,而RNAseq结果提示miR-185-3p在肝纤维化组织中低表达,因此初步选择其作为circRNA＿1989的靶向miRNA;2.q RT-PCR检测结果:相对于Blank组,经TGF-β1刺激活化的LX-2中hsa-miR-185-3p表达减少了60.17%,p<0.05;通过miRbase等数据网站搜索发现miR-185-3p基因序列在人和小鼠种群中具有高度同源性,而相对于Blank组小鼠,DMN给药组小鼠肝纤维化组织中mmu-miR-185-3p表达下调了54.68%,p<0.05;3.Target Scan数据网站搜索可知hsa-miR-185-3p有7个核糖核苷酸与Col1a13’UTR的642-648位点互补;构建Col1a1 WT(野生型)质粒和Col1a1 MUT(突变型)质粒,进行双荧光报告基因实验,结果发现:相对于共转染了Col1a1 WT质粒和miRNA inhibitor NC的细胞,共转染Col1a1 WT质粒和miR-185-3p inhibitor的293T细胞中firefly luciferase与renilla luciferase比值上升了1.87倍,p<0.05,差异有统计学意义;而共转染了Col1a1 MUT质粒和miRNA inhibitor NC与共转染Col1a1MUT质粒和miR-185-3p inhibitor的细胞相比,二者之间firefly luciferase与renilla luciferase比值差异无统计学意义,p=0.993;4.q RT-PCR结果提示:转染miR-185-3p inhibitor后,LX-2中Col1a1和α-SMA表达分别升高了2.12倍和2.97倍,p<0.05;转染miR-185-3p mimics后,LX-2中Col1a1和α-SMA表达分别减少了70.89%和87.77%,p<0.05;Western blot结果提示:转染了miR-185-3p inhibitor的LX-2中Col1a1和α-SMA在蛋白水平表达升高;而miR-185-3p mimics组LX-2中Col1a1和α-SMA则表达减少;5.生物信息学技术预测得miR-185-3p有5个核糖核苷酸与circRNA＿1989的第159-163位点结合;双荧光素酶报告基因检测实验的结果提示:与共转染了原序列质粒和miR-185-3p mimics的细胞相比,共转染了互补序列质粒和miR-185-3p mimics的细胞中firefly luciferase与renilla luciferase比值升高了4.38倍,而共转染突变序列质粒和miR-185-3p mimics的细胞中firefly luciferase与renilla luciferase比值升高了4.46倍,p<0.05;6.q RT-PCR检测发现:相对于NC组,转染了miR-185-3p inhibitor的LX-2中circRNA＿1989表达升高了1.96倍,p<0.05;转染了miR-185-3p的LX-2中circRNA＿1989表达则降低了37.55%,p<0.05;而在LX-2中将circRNA＿1989进行敲减后,经q RT-PCR检测发现:相对于NC组,circRNA＿1989 KD组细胞中miR-185-3p表达升高了1.93倍,p<0.05。结论1.circRNA＿1989与多种miRNA存在位点结合,可能通过充当miRNA分子海绵发挥生物学功能;其中miR-185-3p为其可能性的靶miRNA之一;2.miR-185-3p可能通过靶向Col1a1调控HSC活化的发生,可能具有抑制肝纤维化的作用;3.miR-185-3p与circRNA＿1989具有靶向结合关系,circRNA＿1989可竞争性结合miR-185-3p并减弱其对靶基因Col1a1表达的抑制作用,并逆转其对HSC活化/肝纤维化发生的调控作用。