[背景]心房颤动（Atrial Fibrillation,AF,以下简称房颤）是以心房电活动极快速而紊乱为特征的心律失常。因其增加患者死亡风险,抗AF治疗非常重要,目前房颤治疗的措施均存在局限性。研究发现自主神经系统（Autonomic Nervous System,以下简称ANS）张力失衡与房颤的发生与维持关系密切。通过刺激和消融自主神经,可影响其ANS平衡状态,促进或抑制房颤。脊髓电刺激（Spinal Cord Stimulation,以下简称SCS）通过调控交感副交感神经活性,可纠正ANS张力失衡,并已被成功应用于治疗顽固性心绞痛、心律失常电风暴、顽固性心衰、无休止室速等危急重症,但可否在治疗房颤中发挥作用,国内外尚无系统研究。[目的]对成功建立的房颤犬模型施加颈胸段脊髓电刺激,观察左心房肌的组织细胞形态结构变化、心房重构相关标志蛋白的表达、微小RNA（microRNA,以下简称miRNA）表达谱变化,与空白对照组及非脊髓电刺激房颤犬模型组对比,分析脊髓电刺激对房颤的治疗效果,及对房颤犬左心房重构和miRNA表达谱的影响,探讨脊髓电刺激治疗房颤的可能机制及作用靶点。[方法]1、18只健康成年比格犬随机平均分为空白对照（Ctrl组）,房颤模型对照（AF组）,房颤模型实施脊髓电刺激（SCS组）3组。（1）给AF组及SCS组实验犬植入高频率起搏器,以AOO模式快速起搏右房以建立房颤模型。（2）建模成功的SCS组实验犬植入脊髓电刺激器,刺激电极定位于脊髓背侧T1～T4节段水平,调整参数逐渐增加刺激电压,每次持续刺激2～6小时,共持续12周。（3）将心电追踪仪植入AF组和SCS组实验犬前胸壁皮下,动态监测心电活动和分析房颤负荷。（4）完成模型制作、脊髓电刺激干预后,处死实验犬,留取左心房肌组织,对组织切片行HE染色和Masson染色后,光镜下观察3组实验犬左心房组织的形态学特征及纤维化程度;电镜下观察3组实验犬左心房组织心肌细胞超微结构变化。2、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）及免疫印迹法（Western blot）测定3组实验犬左心房肌组织L-型钙通道蛋白α亚基、缝隙连接蛋白40（Connexin40,CX40）、缝隙连接蛋白 43（Connexin43,CX43）、酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydroxylase,TH）、乙酰胆碱转移酶（Choline Acetyltransferase,CHAT）和生长相关蛋白43（Growth Associated Protein43,GAP43）的mRNA及蛋白表达水平,并统计分析组间差异;免疫组化和免疫荧光法观察上述6种目标蛋白在3组实验犬左心房肌的表达分布,以平均光密度值统计分析各组间表达差异。3、采用miScript miRNAPCR Array检测3组实验犬左心房肌miRNA表达谱,筛选出3组间明显差异表达的miRNA并对其行聚类分析、qRT-PCR验证,运用生物信息学预测软件对差异表达较显著的miR-33a及miR-219-3p的靶基因及其与靶基因的主要结合位点进行预测分析,用KEGG数据库查找靶基因下游信号通路。[结果]1、18只实验犬中3只在房颤建模过程中死亡,其余15只完成实验。（1）AF组和SCS组存活的9只犬植入起搏器,AOO模式下快速右房起搏均成功完成房颤模型制作,房颤出现时间10.45±2.32周,建模成功率75%,建模成功时起搏频率587.82±13.35次/min。（2）心电追踪仪监测到的房颤负荷,SCS组（7.35±2.42）%明显低于AF组（46.45±6.21）%,P<0.05。（3）左心房肌HE染色光镜下表现为:Ctrl组心肌细胞排列整齐、结构完整;AF组心肌细胞排列紊乱,镜下可见少许细胞变性坏死表现,有间质水肿及纤维化;SCS组心肌细胞排列稍紊乱,有少许间质水肿及核浓缩,但程度均较AF组减轻。（4）左心房肌Masson染色光镜下表现为:AF组左心房纤维化程度较Ctrl组明显增加,SCS组也有纤维化表现,但程度较AF组降低。（5）左心房肌电镜下表现为:Ctrl组心肌细胞核内结构正常、肌原纤维节有序排列;AF组心肌细胞有少许肌浆网扩张、线粒体肿胀变形表现,但是表现不突出;SCS组心肌细胞肌原纤维排列相对整齐,无明显线粒体肿胀或肌浆网扩张之表现。2、脊髓电刺激对房颤犬左心房重构标志物的影响qRT-PCR法、Western blot法、免疫组化和免疫荧光四种方法检测3组实验犬的左心房组织中GAP43、TH、CHAT、CX40、CX43、L-型钙通道蛋白α亚基mRNA层面和蛋白层面的表达水平,发现各指标在3组间均存在差异。（1）mRNA表达水平,AF组的GAP43、TH、CHAT表达较Ctrl组上调,CX40、CX43、L-型钙通道蛋白α亚基表达较Ctrl组下调,P均<0.05;SCS组与Ctrl组比较,GAP43、CHAT 表达上调,P<0.05,TH 表达上调但P>0.05,CX40、CX43表达下调,P<0.05,L-型钙通道α亚基表达下调但P>0.05;SCS组与AF组比较,GAP43、TH、CHAT表达下调,P均<0.05,CX40、CX43表达上调,但P均>0.05,L-型钙通道蛋白α亚基表达上调,P<0.05。（2）蛋白表达水平,AF组与Ctrl组比较,GAP43、TH、CHAT表达上调,CX40、CX43、L-型钙通道蛋白α亚基表达下调,P均<0.05;SCS组与Ctrl组比较,GAP43、TH、CHAT表达上调,CX40、CX43、L-型钙通道蛋白α亚基表达下调,P均<0.05;SCS组与AF组比较,GAP43、TH、CHAT表达下调,CX40、CX43、L-型钙通道蛋白α亚基表达上调,P均<0.05。（3）免疫组化染色结果显示,与Ctrl组相比,AF组左心房肌标本中反映心房神经重构的标志蛋白GAP43、TH、CHAT阳性着色反应增加,SCS组也有着色增加,但程度较AF组浅;而反映电-解剖重构的标志蛋白CX40、CX43、L-型钙通道蛋白α亚基在Ctrl组阳性着色反应深,AF组着色明显变浅,SCS组着色介于二者之间。图片处理软件计算平均光密度值并统计分析,AF组与Ctrl组比较,GAP43、TH、CHAT升高,CX40、CX43、L-型钙通道蛋白α亚基降低,P均<0.05,SCS 组与 Ctrl 组比较,GAP43、TH 升高,P 均<0.05,CHAT 升高但P>0.05,CX40、CX43、L-型钙通道蛋白α亚基降低,P均<0.05;SCS组与AF组比较,GAP43、TH、CHAT均降低,P均<0.05,CX40、CX43、L-型钙通道蛋白α亚基均升高,但 P>0.05。（4）免疫荧光显像结果显示,与Ctrl组相比,AF组代表心房神经重构的GAP43、TH、CHAT均高表达,代表心房电-解剖重构的CX40、CX43、L-型钙通道蛋白α亚基均低表达;与Ctrl组相比,SCS组GAP43、TH、CHAT均高表达,CX40、CX43、L-型钙通道蛋白α亚基均低表达;与AF组相比,SCS组GAP43、TH、CHAT均低表达,CX40、CX43、L-型钙通道蛋白α亚基表达差异不明显。利用图片分析软件计算平均光密度值并统计分析,与Ctrl组对比,AF组GAP43、TH、CHAT升高,CX40、CX43、L-型钙通道蛋白α亚基降低,P均<0.05;与Ctrl组对比,SCS 组 GAP43 升高,P<0.05,TH、CHAT 也升高但 P>0.05,CX40、CX43、L-型钙通道蛋白α亚基均降低,P均<0.05;与AF组对比,SCS组GAP43、TH、CHAT降低,P均<0.05,CX40、CX43、L-型钙通道蛋白α亚基均升高但P>0.05。3、脊髓电刺激对房颤犬左心房肌miRNA表达谱的影响miScript miRNA PCR Array筛选3组实验犬左心房肌组织中差异表达的miRNA,按变化倍数（Fold change,FC）>2或<0.5,且P<0.05为判断标准,与Ctrl 组比较,AF 组上调表达的 miRNA 为 let-7a、miR-33a、miR-92b、miR-345、miR-500、miR-875,下调表达的 miRNA 为 miR-30b、miR-143、miR-196b、miR-216a、miR-219-3p、miR-222、miR-665、miR-1306;与 Ctrl 组比较,SCS 组上调表达的miRNA为miR-33a和miR-105b,下调表达的miRNA为miR-122、miR-143、miR-216a、miR-219-3p、miR-222、miR-665、miR-1306;与 AF 组比较,SCS组上调表达的miRNA为miR-30b、miR-105b,下调表达的miRNA为let-7a、miR-33a、miR-92b、miR-375、miR-500、miR-875。qRT-PCR 法对上述差异表达miRNA进行验证,所得结果与miScript miRNA PCR Array筛选结果一致;聚类分析这些差异表达的miRNA,在TargetScan数据库中查找到miR-33a、miR-219-3p有一共同靶基因TLR4,其中miR-33a与TLR4仅有1个非保守作用位点,miR-219-3p与TLR4有1个保守作用位点和2个非保守作用位点。然后从KEGG数据库中查找到TLR4在NF-κ B信号通路中起重要作用。[结论]1、高频率持续起搏右心房制作房颤犬模型安全、有效、成功率高;从90次/分起始,逐渐增加起搏频率,个体化实施间断或持续犬右心房起搏制作房颤模型,可减小实验意外发生率,房颤模型更稳定且更类似慢性房颤发生发展实际情况。2、脊髓电刺激干预犬房颤模型,安全性高,可操作性强。3、脊髓电刺激有效抑制犬房颤的发生和持续,缓解和逆转房颤相关左心房重构及纤维化,有可能用作治疗房颤的手段之一。4、房颤模型犬存在左心房电-解剖重构和神经重构,SCS可缓解和逆转这类重构,尤其是逆转心房神经重构。SCS可能通过调控心脏自主神经进而逆转左心房神经重构。SCS对左心房重构的逆转作用可能对治疗房颤有利。5、SCS可改变房颤犬左心房肌的部分差异miRNA表达,主要涉及的miRNA包括 let-7a、miR-30b、miR-92b、miR-375、miR-500、miR-875,它们可能是脊髓电刺激干预房颤的分子调控机制,进而可能是脊髓电刺激干预房颤的靶点。6、左心房肌差异表达的miR-33a和miR-219-3p,可能通过TLR4/NF-κ B经典炎症信号转导通路参与调控房颤犬的炎症反应,从而影响房颤转归,有可能成为脊髓电刺激治疗房颤的靶点之一。