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第一部分糖尿病印大鼠模型的建立[目的]建立PDE5i治疗效果不佳的糖尿病ED大鼠模型[方法]采用腹腔注射链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠,10周后,对存活的糖尿病大鼠进行阿扑吗啡(APO)筛选实验。以大鼠阴茎体增长、露出作为勃起功能良好的标志,即APO(+)；反之,为APO(-)。随后,对APO(-)和APO(+)糖尿病大鼠进行海绵体压力测定以及PDE5i治疗效果的评价。最后,对APO(-)糖尿病大鼠阴茎组织中NO/cGMP通路、RhoA/Rho激酶通路及细胞凋亡进行检测。[结果]与正常对照大鼠相比,APO(-)糖尿大鼠和APO(+)糖尿病大鼠勃起功能均明显降低,但APO(-)糖尿大鼠勃起功能更差。当给予APO(+)糖尿病大鼠PDE5i(艾力达2.08mg/kg,海绵体测压半小时前灌胃给予,相当60kg成人20mg的等效剂量)治疗后,其勃起功能明显改善,基本上可以达到正常水平,而APO(-)糖尿病大鼠对PDE5i治疗的反应性差,尽管海绵体内压有所提高,但仍远低于正常水平。机制研究发现APO(-)糖尿病大鼠阴茎组织中P-eNOS/eNOS明显下降,ROCK2表达水平和P-MYPT1/MYPT1明显上升,且凋亡细胞显著增多。[结论]阿扑吗啡实验可成功筛选出对PDE5i治疗效果不佳的糖尿病ED大鼠。第二部分糖尿病ED大鼠阴茎组织内miRNAs表达谱分析及验证[目的]筛选出可能与糖尿病大鼠勃起功能相关的重要]miRNAs[方法]提取糖尿病ED大鼠(APO(-)糖尿病大鼠)阴茎组织RNA,采用Agilent Rat miRNA V18.0芯片,对已知的677个miRNAs进行检测。采用Real-time PCR,对差异显著的miRNAs进行验证,同时检测其下游靶基因的mRNA表达水平。[结果]在APO(-)糖尿病大鼠阴茎组织中,3个miRNAs变化明显(下调1/3以上或上调至少3倍,P<0.05vs正常对照组,且探针平均信号值大于4)。其中,miR-133b表达明显下调,miR-92a和miR-29b表达明显上调。采用Real-time PCR方法,发现miR-133b表达下降,miR-92a和miR-29b表达上升,与miRNA芯片结果一致,同时发现niR-92a在阴茎海绵体、主动脉、大脑、肾脏、心脏和肝脏中均有表达。与其他组织和器官相比,miR-92a在阴茎组织中表达丰度相对较低。进一步对niR-92a的下游靶基因进行了检测,结果发现eNOS和DKK3的mRNA表达水平在APO(-)糖尿病大鼠阴茎组织中明显下降,而CD49e、klf2和klf4的mRNA表达水平无明显变化。[结论]miR-92a在糖尿病ED大鼠阴茎组织中高表达可能与eNOS和DKK3的表达水平下调相关。第三部分高糖环境下主动脉内皮细胞中miR-92a及其靶基因的表达变化研究[目的]在体外水平研究高糖对内皮细胞中miR-92a及其靶基因的表达变化[方法]采用贴壁法培养原代大鼠主动脉内皮细胞,在高糖环境下培养后,提取主动脉内皮细胞RNA,对miR-92a、eNOS和DKK3的表达水平进行检测。同时,提取内皮细胞蛋白,对eNOS和DKK3的蛋白表达水平进行检测。在高糖培养下,给予miR-92a拮抗剂antagomir-miR-92a后,提取主动脉内皮细胞RNA和蛋白,检测eNOS和DKK3的表达水平。[结果]在高糖环境下培养48小时和72小时后,miR-92a的表达水平在主动脉内皮细胞中均明显上调,且呈递增趋势；eNOS和DKK3的mRNA表达水平均明显下调,且呈递减趋势。同时,eNOS和DKK3的蛋白表达水平在高糖刺激72小时的主动脉内皮细胞中明显降低。当使用antagomir-miR-92a预处理主动脉内皮细胞后,在高糖环境下培养72小时后,与对照组(antagomir-miR-NC)相比,主动脉内皮细胞中eNOS和DKK3蛋白表达水平明显升高。[结论]主动脉内皮细胞中miR-92a在高糖环境下表达上调,进而抑制eNOS和DKK3表达。第四部分miR-92a-inhibition对糖尿病ED大鼠勃起功能的作用及机制初探[目的]拮抗miR-92a是否可以改善糖尿病ED大鼠勃起功能及初步机制的探索[方法]以慢病毒为载体,构建表达与miR-92a序列互补的miR-92a-inhibition (Lv-miR-92a-inhibition)。用贴壁法培养原代大鼠主动脉内皮细胞,主动脉细胞转染Lv-miR-92a-inhibition后,检测eNOS和DKK3的表达水平。链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠后,采用阿扑吗啡实验筛选出APO(-)糖尿病大鼠。向APO(-)糖尿病大鼠阴茎海绵体内局部注射Lv-miR-92a-inhibition,治疗2周后,采用电刺激海绵体神经测定大鼠阴茎海绵体内压,评价勃起功能。留取大鼠阴茎组织后,对eNOS和DKK3的蛋白表达水平进行检测。[结果]成功构建了慢病毒介导的miR-92a-inhibition,当其转染主动脉内皮细胞96小时后,主动脉内皮细胞中eNOS和DKK3的mRNA和蛋白表达水平明显上调。向APO(-)糖尿病大鼠注射Lv-miR-92a-inhibition2周后,其勃起功能明显改善。初步的机制研究发现Lv-miR-NC-inhibition治疗后,APO(-)糖尿病大鼠阴茎组织中eNOS蛋白表达水平明显上调,接近于正常水平,同时DKK3蛋白表达水平也明显上调,但低于正常水平。[结论]miR-92a-inhibition可能通过上调eNOS和DKK3的表达水平,改善糖尿病ED大鼠勃起功能。