白云边酒发酵过程中不可培养微生物及其分子特征研究

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中国白酒风格各异,都具有自己独特的风味特征。这种独特风格的形成同参与发酵的微生物种类和数量密切相关。白云边酒之所以成为兼香型白酒的典型代表是因为白云边酒生产的独特工艺和环境条件,最重要的是在这种工艺条件和环境条件下,形成的独特的稳定的微生物区系。这种区系的客观存在决定了白云白酒的基础风格。鉴于白云边白酒的特殊风味,广大研究人员希望通过研究大曲、堆积发酵、发酵和窖泥中的全部生物量变化规律来改进白酒的生产工艺。但由于微生物的不可培养性,较难全面的确定白酒生产过程中的优势微生物,从而也无法确定形成白云边酒特殊香型的真正微生物。分子生物学、基因工程等学科的飞速发展,为研究白云边白酒特殊香型的形成提供了良好的研究条件。本研究试图通过对总微生物的动态变化研究和采用DGGE (denaturing gradient gelelectrophoresis,即变性梯度凝胶电泳)技术分析在大曲、堆积发酵、发酵和窖泥等工艺过程中的微生物变化动态,找出在白云边白酒生产过程中的优势微生物(包括不可培养的微生物),从而确定形成白云边酒特殊香型的真正微生物。本研究对可培养细菌、真菌、放线菌和酵母菌的培养和动态变化,确定可培养的微生物总量,中温曲中细菌约1.4×106,酵母菌约5.6×105,霉菌约3.0×103;高温曲中细菌约4.8×103,酵母菌约3.1×103,霉菌约4.5×102和少量放线菌;不同处理培养基对微生物影响进行测定,确定用混合培养基10%,丙酮酸钠0.125%/2,培养基稀释2倍的处理方法微生物数量最多;不可培养的微生物的总量培养和动态变化研究,采用艾氏管发酵活性法测定,可以从产生co2量确定不同堆积时间的堆积发酵产物中微生物变化情况,确定在培养基中加入葡萄糖时,微生物活性最高,产气最快,从而大致确定微生物的产气以是酵母菌为主,同时用此方法可以大致确定不同的堆积发酵产物所产酒酒质的差别,为高效改进白云边酒的生产工艺提供理论基础;堆积发酵产物中的微生物高效富集研究,确定TE缓冲液和普鲁兰糖有很好的富集和絮凝效果,为研究堆积发酵产物中单一微生物提供了可靠的方法。对大曲、堆积发酵、发酵和窖泥等工艺过程中的微生物总DNA进行提取,并以总DNA为模版进行16SrDNAV1区和18SrDNAV3区的PCR扩增,用PCR产物进行DGGE分析。电泳条带的数目、位置和强度可反映样品中微生物的种类及其的相对构成比例,反映样本的微生物结构及组成,每个条带分别代表一个微生物菌种,从数据和图的信号强弱看,各酒种中都有比较多的优势细菌菌种,说明细菌在生产酒的过程中起了很大作用,除浓香型窖泥以外,酒厂中有一种比较稳定的优势真菌菌种,估计这个菌株就是产酒真菌,说明产酒真菌主要在曲和酒醅中。通过对比找到不同香型微生物的差异,整个细菌菌类比较接近,浓香型香型类在整个生产工艺中,细菌类菌株偏多,这说明细菌能较多的决定白酒的浓香型香型特点,细菌生长的营养物质能影响白酒的风味,而整个真菌类,白云边的兼酱香型和酱香型类比浓香型类酒多,这说明真菌能影响白酒的酱香型。
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