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炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性消化道炎性疾病,包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。IBD的严重并发症之一为结直肠癌(colorectal cancer,CRC),世界范围内IBD发展为CRC的风险为5-40/10万。调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg),是发挥负调功能的免疫抑制性细胞,主要分泌IL-10和TGF-β等抑炎因子,可抑制效应性T细胞应答,参与维持机体的免疫自稳。肠道免疫稳态被打破所导致的肠道免疫紊乱在IBD的发生发展中起重要作用,其中Th1,Th2,Th17等各种效应性细胞亚群参与介导炎性紊乱,而Treg作为调节性T细胞,可平衡、负向调节上述各种效应性T细胞的炎性反应,从而在IBD的发病机制中占有重要地位。磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinases,PI3Ks)是生长因子调控信号通路中的重要分子,在炎症、增殖、分化、凋亡、糖代谢等发面发挥非常重要的作用。PI3K分为Class I(IA和IB)、II、III型,其中Class IA型PI3K由催化亚基(p110α/β/δ)和调节亚基(p85α/β,p55α/γ,p50α)组成的异二聚体。p55PIK(p55γ)与经典的调节亚基p85在基因结构上不同之处为其N末端含24个氨基酸组成的结构域(N24),是p55PIK与其他调节亚基之间的唯一区别。本课题组利用分子生物学技术合成TAT-N15融合肽(N24中的15个短肽与HIV透膜蛋白重组),作为p55PIK特异性抑制剂。关于非经典的PI3K调节亚基p55γ(即p55PIK)的生物学作用鲜有报道。本课题组对p55PIK相关的信号通路及其与肿瘤和炎症的关系开展了较深入研究,并取得了如下进展:在肿瘤方面,首次证实p55PIK与p85不同,可通过N24募集其他蛋白分子(如Rb和PCNA),并通过i-SH2结构域结合的p110催化亚基使Rb和PCNA发生磷酸化,从而促进肿瘤细胞增殖和肿瘤发生;在炎症方面,首次发现,在LPS所介导的炎症反应中,p55PIK通过Akt非依赖途径,诱导NF-κB信号通路中的p65磷酸化,从而促进单核细胞分泌促炎细胞因子。有报道表明,经典的PI3K调节亚基p85对Treg分化发挥负性调控,但是p55PIK对Treg的调节尚不清楚,未见国内外相关研究的报道。结合上述前期结果,我们提出科学问题:p55PIK能否通过影响Treg而在慢性结肠炎恶性转化中发挥作用?本课题以AOM-DSS诱导的小鼠慢性结肠炎癌变模型为研究对象,以p55PIK特异性抑制剂(TAT-N15)为治疗工具,以生理盐水(NS)、对照多肽(CP)为对照,分组如下:NS组(模型组)、CP组(阴性对照组)、TAT-N15组(实验组)。模型过程DSS诱导同时每天检测体重、粪便潜血。在AOM-DSS模型中选取以下时间点:急性炎症期(Day8)、慢性炎症恢复期(Day37)、结直肠炎相关肿瘤期(Day70)分别处死小鼠,检测结肠长度和HE染色(病理改变);在各时间点:取小鼠脾脏、肠系膜淋巴结及结肠组织,以ELISA检测结肠组织匀浆促炎细胞因子(TNF-a、IL-1β、IL-6)和抑炎细胞因子(IL-10、TGF-β)的变化,以流式细胞术检测脾脏、肠系膜淋巴结中Treg(CD25+Foxp3+/CD4+)比例,以免疫组化法检测结肠组织中Treg(Foxp3+细胞)数量。观察p55PIK抑制剂可否缓解AOM-DSS模型中的炎症症状和模型末的肿瘤形成以及探讨p55PIK对结肠炎和结直肠肿瘤作用的可能机制。在体内实验基础上,进一步利用体外小鼠Treg细胞分化实验:无菌条件下获取C57BL/6小鼠的脾脏、肠系膜/腹股沟/腋下等淋巴结,制备细胞悬液,磁珠、流式分选CD44lowCD62Lhigh Na?ve T细胞。在抗CD3和抗CD28共刺激信号活化TCR的同时,加入不同浓度的TAT-N15或CP,再加入TGF-β和IL-2进行初始T细胞的体外分化,72h后收集细胞,流式检测Treg细胞(CD4+Foxp3+)的比例,观察p55PIK对Treg分化的影响。结果如下:一.p55PIK通过调节Treg促进慢性结肠炎的发生发展1.AOM-DSS诱导的小鼠慢性结肠炎癌变模型的构建体重和粪便潜血评分随着2.5%DSS的诱导而呈现有规律的波动,符合慢性结肠炎的临床改变特征,在此基础上,进一步成功构建AOM-DSS诱导的小鼠慢性结肠炎癌变模型。2.p55PIK抑制剂(TAT-N15)可缓解AOM-DSS模型中炎症期的基本炎症性状p55PIK特异性抑制剂TAT-N15可缓解AOM-DSS模型中急性炎症和慢性炎症期的基本性状:TAT-N15可缓解小鼠慢性结肠炎导致的体重减轻(p<0.01或p<0.001),对粪便潜血无影响(p>0.05)。在急性炎症期(Day8)和慢性炎症恢复期(Day37),TAT-N15均可有效缓解DSS诱导所致的结肠长度缩短(p<0.05)和结肠炎病理学变化(p<0.01,p<0.05)。提示p55PIK可能参与促进小鼠慢性结肠炎导致的体重减轻,结肠长度缩短和结肠炎病理学变化,从而促进AOM-DSS模型中的急性和慢性炎症的基本炎症性状。3.p55PIK抑制剂(TAT-N15)可抑制小鼠慢性结肠炎结肠组织中的促炎细胞因子表达在急性炎症期(Day8),小鼠结肠匀浆中,TAT-N15组的TNF-a和IL-6水平均低于CP组和NS组(p<0.05),而IL-1b的表达在三组间无统计学差异;在慢性炎症恢复期(Day37),TAT-N15组的IL-1b和IL-6水平均明显低于CP组和NS组(p<0.05),而TNF-a的表达在三组间无统计学差异;以上结果表明:TAT-N15可抑制急性炎症期(Day8)的促炎细胞因子TNF-a和IL-6的表达,抑制慢性炎症恢复期(Day37)的IL-1b和IL-6的表达。提示p55PIK可以促进AOM-DSS模型中急性炎症期促炎细胞因子(TNF-a和IL-6)、慢性炎症期促炎细胞因子(IL-1b和IL-6)的表达。4.p55PIK抑制剂(TAT-N15)可促进小鼠慢性结肠炎结肠组织中的抑炎细胞因子表达在急性炎症期(Day8)和慢性炎症恢复期(Day37),与CP组和NS组相比,TAT-N15组的结肠匀浆中IL-10的表达差异均无统计学意义;而TAT-N15组的结肠匀浆中TGF-β的表达均显著高于CP组和NS组(p<0.001)。以上结果表明:在急性炎症期(Day8)和慢性炎症恢复期(Day37),TAT-N15可促进结肠组织中抑炎细胞因子TGF-b的表达。该结果提示:p55PIK可以抑制急性和慢性炎症期抑炎细胞因子TGF-b的表达。5.p55PIK抑制剂(TAT-N15)可增加小鼠慢性结肠炎的Treg比例在AOM-DSS模型中的慢性炎症恢复期(Day37),与CP组和NS组相比,TAT-N15可增加脾脏和结肠组织中的Treg比例(p<0.05,p<0.01),而在肠系膜淋巴结中无显著性差异。TAT-N15对急性炎症期的Treg比例(脾脏、肠系膜淋巴结和结肠组织中)无影响(p>0.05)。该结果间接提示:在AOM-DSS慢性炎症期中,p55PIK可能发挥负调Treg(脾脏和结肠组织中)的作用。而p55PIK对急性炎症期的Treg比例(脾脏、肠系膜淋巴结和结肠组织中)无影响。二.p55PIK通过调节Treg促进炎症相关性结直肠肿瘤的发生1.p55PIK抑制剂(TAT-N15)可降低炎症相关性结直肠肿瘤的数量在肿瘤期(Day70),检测各组小鼠的肿瘤数量,结果表明:TAT-N15可抑制炎症相关性结直肠肿瘤的发生,降低肿瘤个数(p<0.001)。2.p55PIK抑制剂(TAT-N15)可增加炎症相关性结直肠肿瘤小鼠Treg比例TAT-N15可增加炎症相关性结直肠肿瘤小鼠脾脏(p<0.001)、肠系膜淋巴结(p<0.01)和结肠组织Treg比例(p<0.05),提示在AOM-DSS模型肿瘤期,p55PIK可能通过负调Treg而促进炎症相关性结直肠肿瘤的发生发展。三.p55PIK在体外负调Treg细胞的分化在小鼠体外T细胞分化实验基础上,观察TAT-N15对Treg分化的影响。结果显示:TAT-N15可促进na?ve T细胞分化为Treg(p<0.05)。提示p55PIK可能发挥负调Treg细胞分化的作用。结论:1.p55PIK特异性抑制剂TAT-N15可缓解AOM-DSS模型中急性和慢性炎症期的炎性基本性状,其机制可能是TAT-N15通过降低急性和慢性炎症期促炎细胞因子,促进抑炎细胞因子的表达,并且通过增加慢性炎症期中脾脏和结肠组织中的Treg比例而发挥作用。2.在AOM-DSS模型肿瘤期,TAT-N15可抑制炎症相关性结直肠肿瘤的发生发展。其机制可能是TAT-N15可增加肿瘤期小鼠脾脏、肠系膜淋巴结和结肠组织的Treg比例。3.TAT-N15可在体外促进小鼠na?ve T细胞分化为Treg细胞。上述结果同时提示:1.p55PIK可能促进急性和慢性炎症促炎细胞因子的表达,抑制抑炎细胞因子的表达,并且在慢性炎症中负调Treg的比例而促进AOM-DSS模型中的炎症期炎性反应。2.p55PIK可能通过负调Treg而促进小鼠AOM-DSS肿瘤期肿瘤的发生发展及炎癌恶性转化。3.p55PIK可在体外负调Treg细胞的分化。4.以PI3K调节亚基为靶点,以TATN15在体内干扰炎症性肠病及其相关肿瘤,可望为治疗炎症性肠病和相关肿瘤提供新的策略和思路。本课题首次证明TAT-N15在体内通过增加Treg的比例而抑制小鼠慢性结肠炎恶性转化,TAT-N15在体外可促进小鼠Treg细胞的分化。该研究成果不但可阐明PI3K非经典途径在Treg分化中的作用,而且为防治IBD等自身免疫病提供了新的靶点及手段。