梨火疫病是由解淀粉欧文氏菌（E.amylovora）引起的一种细菌性病害,对果树具有毁灭性危害,寄主范围广,传播速度快,迄今为止E.amylovora的防治依然是国际难题。目前该病害的检疫鉴定方法主要有症状检测、分子生物学检测、免疫学检测等,然而这些技术操作繁杂、耗费时间、灵敏度也具有一定的局限性。因此在生产中亟需开发一种适应于田间且科学有效、成本较低的检测方法,以便人们及时防治梨火疫病。CRISPR-Cas系统是一种新型基因编辑技术,具有很强的靶标特异性,最近研究发现,Cas12a蛋白在识别靶标后可以对体系中任意单链DNA进行不加区别的切割。基于这一特性,本试验以E.amylovora为主要研究对象,通过将不对称RPA扩增技术与CRISPR-LbCas12a荧光检测技术相结合,构建了田间可视化检测体系,从而实现对E.amylovora高效、快速的检测目的,为梨火疫病的早期防治提供科学依据,具体研究结果如下:1.基于CRISPR-LbCas12a反式切割活性的特点,通过荧光报告基团检测新PAM（YTV）和不同类型的靶标序列对LbCas12a的影响,结果表明新PAM（YTV）可以辅助LbCas12a识别靶标序列;在不同类型的靶标中,ssDNA激活LbCas12a时不需要PAM序列的辅助,而dsDNA激活LbCas12a时必须在PAM和crRNA的相互作用下进行。2.本试验以对称RPA和不对称RPA扩增的E.amylovora目标序列为靶标,通过荧光报告基团检测了其对LbCas12a切割活性的影响,结果表明,对称RPA扩增E.amylovora的目标序列只在crRNA含有PAM位点（TTTV）的情况下激活LbCas12a的切割活性,而不对称RPA扩增E.amylovora的目标序列可以在crRNA任何类型的下激活LbCas12a的切割活性。进一步表明本试验建立了不对称RPA结合CRISPR-LbCas12a技术对E.amylovora可视化检测体系。3.将高温裂解提取的细菌DNA粗提液用于不对RPA扩增底物,预扩增10 min后与LbCas12a结合,并通过紫外分析仪检测发现,只有在完整的LbCas12a体系下才会显示绿色荧光,由此建立了不对称RPA扩增与LbCas12a荧光检测E.amylovora相结合的一管化反应体系,有效减少了试验过程中开盖带来的干扰。4.本试验以不同水果表面微生物群落DNA的粗提液作为RPA扩增底物,通过高通量测序和生物信息学分析以及CRISPR-LbCas12a技术对E.amylovora进行荧光检测,均没有发现E.amylovora的存在,这一结果表明CRISPR-LbCas12a技术具有较高特异性。在最佳反应条件下,CRISPR-LbCas12a检测E.amylovora的灵敏度为6.4×10~3 cfu·m L-1,与q PCR技术检测灵敏度一致,比常规PCR的灵敏度相比提高了10倍。因此,表明本试验建立的CRISPR-LbCas12a技术对E.amylovora可视化检测体系具有较高的特异性和灵敏度,在田间实际检测中具有很大的应用潜力。本研究建立了一种不对称RPA扩增结合CRISPR-LbCas12a技术对E.amylovora可视化检测方法,该方法在37℃恒温反应条件,通过不对称RPA扩增极大提高了反应灵敏度,并且突破了PAM序列（TTTV）的限制,检测流程简便,无需大型检测设备,实现细菌DNA检测的探针具有通用性,可在50 min内检测多个样本,其检测下限为6.4×10~3 cfu·m L-1,具有良好的特异性和高灵敏度,成本低,效率高,在实际生产中可以对田间样本进行鉴定。