脐血作为造血干细胞的来源之一具有来源广泛、采集方便、免疫配型要求低、移植后移植物抗宿主病发生率低等优点，被广泛应用于治疗血液系统疾病。然而，单份脐血所含的造血干细胞绝对数量有限，往往不能满足成人移植的需要，从而限制了脐血在临床上的广泛应用。近年来快速发展起来的造血干细胞体外扩增技术为解决脐血造血干细胞数量不足的问题带来了希望。 理想的造血干细胞体外扩增技术要求既能最大限度地扩增造血细胞，又要保证其生理功能不受影响。但是，由于目前人们对体内造血微环境的认识十分有限，所采用的体外培养环境与体内造血微环境之间还存在很大差异，致使造血干细胞经过体外扩增后其生理功能发生显著变化，甚至完全丧失其原有的造血重建功能，因此研究和认识体外培养环境对造血干细胞生理功能的影响，对于优化体外培养条件，建立既能大量扩增造血干细胞又能保持其正常生理功能的体外扩增过程具有重要的科学意义和实际应用价值。 为此，本文以NOD/SCID小鼠为模型，首先从动/静态培养模式、培养时间等方面入手探讨体外培养条件对造血干细胞造血重建功能的影响，然后采用免疫缺陷小鼠重建细胞(SCID-repopulating cell，SRC)定量分析方法，进一步比较培养前后CD34+造血干细胞造血重建功能的差异。最后，本文还对培养前后造血干细胞重建小鼠巨核造血系统以及人血小板生成特点进行了考察和分析。 为了考察动/静态培养模式对造血干细胞扩增及其造血重建功能的影响，本文采用SCF+TPO+FL+IL-3+IL-6细胞因子组合在24孔板和转瓶中培养单个核细胞(MNC)，发现体外培养7d后，静态培养的总细胞、CD34+细胞和集落形成细胞(CFC)分别扩增了2.27、3.23和3.34倍，而在动态培养模式下总细胞、CD34+细胞和CFC仅扩增了0.79、0.93和1.17倍，表明静态培养较动态培养更有利于脐血造血细胞的扩增。然后，对上述两种培养模式收获的细胞进行CD34+细胞和CD34-细胞分离，然后将4×105个CD34+细胞和5×106个CD34-细胞混合输注NOD/SCID小鼠，进行体内移植试验，6周后取小鼠骨髓和脾脏，分别检测人源CD45+细胞和其它各系人源血细胞含量以及集落密度，结果发现无论是静态培养还是动态培养模式收获的造血细胞，在NOD/SCID小鼠体内均具有造血重建功能，但是在输注动态培养细胞的NOD/SCID小鼠骨髓和脾脏中，人源CD45+细胞的含量分别为30.13％和19.64％，显著高于输注静态培养细胞的小鼠(6.81％和1.00％)，而且进一步检测小鼠骨髓和脾脏中的各系人源血细胞含量和集落密度，也发现动态培养的细胞在小鼠体内的重建能力高于静态培养的造血细胞。由此可见，虽然两种培养模式所获得的脐血造血细胞都保持了造血重建功能，但其细胞扩增和生理功能还是存在显著差异，其中在静态培养模式下细胞扩增好于动态培养，而就细胞植入能力而言后者则要优于前者。 为了考察体外培养时间对造血干细胞扩增及其造血重建功能的影响，本文以MNC为起始细胞并且在SCF+TPO+FL细胞因子组合的条件下体外培养7d和14d，分别进行各系造血细胞扩增检测和NOD/SCID小鼠体内移植试验。结果发现MNC经过7d和14 d培养后，总细胞分别扩增了2.05和0.82倍，CD34+细胞扩增了3.22和1.04倍，延长培养时间反而导致了细胞扩增水平的下降。进一步检测细胞表型发现，MNC经过14 d培养后其中对降低GVHD风险有利的T、B淋巴细胞含量低于7d培养的MNC，而能够促进植入的CD33+细胞含量则比培养7d的MNC有明显提高。取上述培养7d和14 d的造血细胞，分离CD34+细胞和CD34-细胞，然后将4×105CD34+细胞和5×106 CD34-细胞输注NOD/SCID鼠体内，6周后取小鼠骨髓和脾脏，检测人源CD45+细胞和各系人源血细胞含量以及集落密度，发现上述体外扩增的人体造血细胞在NOD/SCID小鼠体内均具有造血重建功能，但是体外培养14 d的造血细胞在NOD/SCID小鼠体内的各项植入指标高于体外培养7d的造血细胞，其中移植前者的小鼠骨髓和脾脏中人源CD45+细胞的含量分别为70.26％和55.68％，显著高于移植后者的小鼠(3.49％和1.16％)，小鼠体内其它各系人源血细胞含量以及集落密度也明显高于后者，表明体外培养14 d后所获得的造血细胞具备较强的植入能力以及多系造血重建和集落形成能力。 最后，本文采用SCF+TPO+FL细胞因子组合培养富集的脐血CD34+细胞，并考察其SRC含量和造血重建功能，发现CD34+细胞在体外培养过程中，至第10 d时CD34+CD38-、CD41+和CD34+CD41+细胞扩增最多，其扩增倍数分别达到10.49、30.36和12.25倍。然后，将5×103、1×104、5×104、1×105和2×105个新鲜分离的CD34+细胞以及由2.5×103、5×103、1×104、5×104、1×105和2×105个新鲜CD34+细胞起始培养10 d后得到的全部造血细胞分别输注NOD/SCID小鼠，进行体内移植试验。结果发现体外培养10 d收获的CD34+细胞中SRC含量为1/17，721，比新鲜脐血CD34+细胞中的SRC含量(1/45，009)扩增了约2.54倍。在此基础上，本文进一步考察了新鲜CD34+细胞和体外培养10 d后收获的CD34+细胞在重建NOD/SCID小鼠巨核造血系统方面的功能差异。结果发现，在输注体外培养CD34+细胞的NOD/SCID小鼠体内，人源血小板数量明显高于输注新鲜CD34+细胞的小鼠，而且小鼠体内人源血小板的生成速度快，小鼠自身血小板的恢复期也明显缩短，说明CD34+细胞经过体外培养和扩增后，能够促进人源血小板在小鼠体内的植入，同时有利于小鼠恢复自身血小板的数量。