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背景:瘢痕是哺乳动物皮肤后天对创伤进行修复的一种生理反应,而作为创伤过度修复的病理性瘢痕形式之一的瘢痕疙瘩（Keloid,K）为人类所独有,被认为是一种纤维化疾病,其特征是成纤维细胞（Fibroblast,Fb）的过度增殖和细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）的异常大量生成并沉积于皮肤真皮组织,临床表现为增生的纤维组织向创伤边界外侵袭性生长。迄今为止,瘢痕疙瘩的发病机制仍不清楚,且缺乏有效的治疗手段,对患者身体和心理造成严重不良影响,故对瘢痕疙瘩发病机制的阐释仍是目前的热点话题。现有的研究证明,间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells,MSCs）具有减轻伤口炎症、促进组织再生并抑制组织纤维化的作用,但瘢痕疙瘩组织中数量增多的MSCs（keloid-derived mesenchymal stem cells,KD-MSCs）的作用还没有得到深入的研究。临床上,瘢痕疙瘩具有沿皮肤组织张力线向特定方向侵袭的特点,近几年各国学者研究证实,牵张力在瘢痕疙瘩的不同发展阶段发挥着关键性作用。然而,牵张力是否对KD-MSCs产生影响进而参与瘢痕疙瘩的发病过程,目前尚未阐明。目的:研究牵张力作用下KD-MSCs培养上清对瘢痕疙瘩成纤维细胞（keloid fibroblasts,KFs）增殖及胶原蛋白生成的作用,阐释牵张力作用下的KD-MSCs是否通过旁分泌作用影响KFs的生物活性,为阐明瘢痕疙瘩的发病机制提供新的思路。方法:1.KD-MSCs的分离、培养及鉴定。采用胰蛋白酶法分离KD-MSCs、干细胞培养基培养KD-MSCs。选取处于对数生长期的MSCs分别显微镜观察、绘制生长曲线、定向诱导成骨成脂多向分化及流式细胞术等实验进行MSCs的鉴定。2.KFs的分离、培养及鉴定。采用组织块贴壁法分离KFs、用含10%FBS的DMEM培养液培养KFs。通过显微镜观察和波形蛋白免疫细胞化学染色鉴定KFs。3.牵张力组和无牵张力组KD-MSCs培养上清的收集。采用鼠尾Ⅰ型胶原贴壁及悬浮制作牵张力组和无牵张力组模型,于72h收集牵张力作用下和未施加牵张力的KD-MSCs培养上清。于6孔培养板中接种KFs,24h后,KFs贴壁,更换含有10%未施加力和受力KD-MSCs培养上清的培养基,且培养48h,用显微镜观察细胞形态学的变化4.牵张力组和无牵张力组KD-MSCs培养上清对KFs增殖的影响。将KFs接种于96孔板,24h后,KFs贴壁,将含有10%未受力和受力KD-MSCs培养上清的培养基用于培养KFs,之后培养24h、48h、72h、96h,采用细胞计数试剂盒（Cell Counting Kit-8 assay,CCK-8）染色法检测KFs增殖活性。5.牵张力组和无牵张力组KD-MSCs培养上清对KFs表达Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及CTGF mRNA的影响。将KFs接种于6孔板,24h后,KFs贴壁,用含有10%未受力和受力KD-MSCs培养上清的培养基孵育KFs,接着培养24h后,用于RNA的提取、cDNA的反转录以及实时定量PCR检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及CTGF的基因表达。6.牵张力组和无牵张力组KD-MSCs培养上清对KFs表达Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白的影响。将KFs接种于24孔板,24h后,KFs贴壁,且将含10%未受力和受力KD-MSCs培养上清的培养液培养KFs,随后培养24h、48h、72h,之后按照羟脯氨酸（Hydroxyproline,Hyp）试剂盒方法检测Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原蛋白表达。结果:1.KD-MSCs可以定向诱导成骨成脂,说明KD-MSCs具有干细胞的特征。流式细胞仪（Flow cytometer,FCM）结果显示分离出的KD-MSCs高表达CD29、CD44、CD73等MSCs表面标志,其中CD29阳性率最高,低表达CD45等造血干细胞表面标志,说明KD-MSCs具有MSCs的表型特征。2.Fb的原代组织块培养法时间较长,Fb从组织团块周围爬出较缓慢。原代细胞界限较清楚,KFs排列不规则,可见交叉重叠现象。传代后细胞增殖速度加快,镜下观察细胞形态以均一长梭型为主,细胞增殖活跃。3.牵张力组和无牵张力组的主要镜下表现为细胞呈均一长梭形,漩涡状或放射状,生长变快、突起变得粗大,间隙变窄,细胞轮廓变深。显微镜下观察,牵张力作用下和无牵张力作用下KD-MSCs培养上清对KFs形态的影响未见明显差异。4.CCK-8细胞增殖实验结果显示:于24h时,牵张力组与无牵张力组对比,其之间的差异在统计学上有意义（t=2.76,P<0.05）。但是,48h、72h、96h时,牵张力组和无牵张力组比较,两组间的差异在统计学上无意义(t48h=1.43,t72h=1.55,t96h=0.48,P>0.05)。5.Real-time PCR实验结果显示:牵张力组和无牵张力组之间比较,Ⅰ型胶原mRNA的表达呈显著的增高（t=14.51,P<0.01）,但Ⅲ型胶原与CTGF mRNA的表达却提示降低（t=5.20,P<0.05;t=16.04,P<0.01）。6.羟脯氨酸比色法结果显示:牵张力作用下和无牵张力作用下KD-MSCs培养上清培养KFs之后,Hyp的表达量显著增多,在24h时间点,其之间差异最为明显,在统计学上有差异（t=4.88,P<0.05）。然而,48h、72h时,牵张力组与无牵张力组比较,差异无统计学意义(t48h=1.53,t72h=3.23,P>0.05)。结论:本研究成功培养了KD-MSCs及KFs,采用鼠尾Ⅰ型胶原贴壁及悬浮制作牵张力组和无牵张力组模型,在此基础上证实,牵张力组KD-MSCs培养上清可促进KFs的增殖,促进KFs表达Ⅰ型胶原mRNA及蛋白,降低KFs表达Ⅲ型胶原mRNA及蛋白,降低KFs表达CTGF mRNA。表明牵张力可以作用于KD-MSCs并诱导其分泌与成纤维细胞增殖及胶原蛋白产生的细胞因子,而KFs的过度增殖以及Ⅰ型胶原与Ⅲ型胶原比例增高正是瘢痕疙瘩病理改变的特征,这提示牵张力作用下的KD-MSCs通过旁分泌作用可能参与了瘢痕疙瘩的发病过程。