不同方法分离纯化对猪胰岛细胞的体外培养活性及功能影响的研究

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一型糖尿病是一种世界范围性疾病,目前全球约有5亿人患有糖尿病,由糖尿病并发症引发的死亡将会超过60%。目前分离提取胰岛的方法主要有胶原酶消化法、机械剪碎发,冷冻解冻法等,而选择性渗透压法是近年来发现纯化幼年小鼠胰岛细胞的新方法,作用效果明显,其纯化效果亦在幼年猪胰岛细胞得到证实,但在成年猪胰岛细胞是否还具有相同效果未见报道,血红素氧化酶-1(hemeoxygenase-1,HO-1)具有抗炎、抗氧化及抗凋亡作用,参与器官移植、冷冻损伤和急、慢性排斥过程中起到细胞保护作用。在小鼠等动物的异种移植实验中已证明其保护作用明显,但对于体外培养的成年猪胰岛细胞是否还具有相同的保护作用亦未证实。因此,本文以成年猪胰岛为研究对象,并结合本实验室研究猪胰岛细胞分离纯化研究所积累的成功经验,对胰岛的获得、纯化、功能活性以及血红素氧化酶-1能否对体外培养的胰岛细胞产生保护作用进行分析,并对可能的机制进行初步研究。研究结果表明:采用选择性渗透压法(SOS)分离的胰岛当量(IEQ)589104.80±82581.40显著高于胶原酶法分离提取的胰岛细胞当量(IEQ)267432±31512.27(p<0.05);每克组织分离胰岛当量7213.47±432.27(IEQ/g)显著高于胶原酶法分离提纯胰岛当量3045±986(IEQ/g)(P<0.05);胰岛纯度87±2%显著高于胶原酶法分离纯化的胰岛纯度73±3%,选择性渗透压法分离胰岛在葡萄糖刺激后胰岛素分泌的增加大约是对照组的三倍(3.06±0.22 VS0.97±0.085)。  将原卟啉钴(CoPP)应用到分离胰岛细胞的短期培养,发现由CoPP诱导产生的血红素氧化酶-1的表达量高于对照组,确定血红素氧化酶-1对猪胰岛细胞保护作用的影响:将纯化的胰岛细胞随机分成五组,将CoPP设计五个药物浓度:0μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L、160μmol/L与胰岛细胞进行共培养,采用DTZ法染色、ELISA胰岛素释放试剂盒和PCR分子检测。结果表明:最佳浓度为80μmol/L,最佳培养时间为36h诱导血红素氧化酶-1的过表达,处理后的胰岛细胞其糖刺激指数高于对照组,但差异不显著,说明血红素氧化酶-1对体外培养的胰岛细胞起到一定的保护作用。本文研究结果表明,采用选择性渗透压法可以实现高纯度高活性分离提取胰岛,而钴原卟啉(CoPP)可以诱导体外培养的猪胰岛细胞的血红素氧化酶-1过表达,胰岛素释放量增加,对胰岛细胞凋亡起到一定的保护作用,从而实现维持体外培养的胰岛细胞活性,为成功胰岛移植奠定基础。
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