背景与目的结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤之一,是多因素作用、多基因参与、多阶段形成的复杂病理过程,其发病率以及死亡率具有逐年上升的趋势,严重威胁着人类的生命及健康安全。结直肠癌的临床治疗主要包括手术、放疗、化疗、热疗及免疫治疗及传统的中医治疗,目前手术仍然是最主要而且最有效的方法,但是术后5年生存率却只有50%。结直肠癌早期诊断困难、早期转移常见、对化疗的抗性以及化疗的巨大毒性等都使其治疗与预后变得异常艰难。因此,对结直肠癌的早期诊断与新的治疗手段如基因治疗、靶向治疗等的研究就显得很重要。近年来研究已经证实,膜联蛋白A2(Annexin A2,ANXA2)是与多种肿瘤的发生和发展密切相关的基因,其表达在人类绝大多数肿瘤中均上调,这种过表达现象可能与肿瘤的生长、浸润、转移等有关。研究基因的功能常用基因敲除(Gene deletion)或基因敲低(Gene inhibition)方法,前者是目前应用较为广泛的基因组编辑技术之一,其完全彻底、高度特异性的对靶基因表达的去除作用使其发展成为基因功能研究强有力的手段。本研究采用传统基因敲除技术,从基因组水平彻底消除ANXA2基因在人结直肠癌caco2细胞中的表达,从而建立了完全无ANXA2表达的caco2细胞系(ANXA2-/-caco2)。并通过对这种完全无ANXA2表达细胞的增殖、运动等特性的检测,探索ANXA2基因对caco2细胞生物学行为的影响。在此基础上,利用双向电泳以及质谱分析等技术对ANXA2基因敲除结直肠癌细胞蛋白组学进行初步研究,试图揭示ANXA2基因敲除对结直肠癌caco2细胞蛋白组的影响,获得可能与ANXA2功能相关的基因成员,初步了解4NXA2在结直肠癌中的作用及可能的信号通路组成,为进一步深入研究ANXA2在结直肠癌中的信号通路的调节和转导奠定初步基础。此外,为了对文献多次报道的与ANXA2功能关系密切的组织纤溶酶原激活因子(Tissue plasminogen activator, tPA)基因功能进行研究,并与ANXA2基因敲除形成互对应研究,本研究曾试图以转录激活子样效应因子核酸酶(Transcriptional activator-like effector nucleases, TALEN)技术为靶向基因编辑工具,试图从人结直肠癌细胞caco2细胞中将tPA基因敲除,以期得到tPA敲除的caco2细胞,再与本实验室已经构建好的ANXA2敲除caco2细胞系共同作为研究对象,进一步了解ANXA2与tPA两个肿瘤相关基因在结直肠癌caco2细胞中的相互作用及可能的作用机制,以深入探索ANXA2与tPA在人结直肠癌的发生与发展中的作用,从而为结直肠癌的早期诊断和治疗提供更为详实的理论和实验依据,为结直肠癌防治和预后评估提供新的思路。方法1.ANXA2基因敲除caco2细胞系(ANXA2-/-ca.co2)的构建与鉴定(Western blot)。2.检测细胞活性,并分析ANXA2在不同时间点对caco2细胞增殖能力的影响(MTT法、倒置荧光显微成像系统)。3.检测ANXA2在不同时间点对caco2细胞运动能力的影响(损伤修复法、Transwell小室实验)。4.检测ANXA2基因敲除后对结直肠癌细胞蛋白组的影响(蛋白质双向电泳、质谱分析法、生物信息学分析)。5.tPA基因敲除caco2细胞系的构建(TALEN技术)。结果1. Western blot方法鉴定结果显示ANXA2基因敲除caco2细胞系(ANXAT2-/-caco2)构建成功。2.MTT实验结果表明ANXA2基因的敲除导致caco2细胞的增殖能力受到明显的抑制(**P<0.01)。3.损伤修复法实验结果表明ANXA2基因敲除的caco2细胞迁移能力明显下降,特别是48h后对细胞迁移能力抑制更为显著(*P<0.05)。Transwell小室实验结果也同样说明ANXA2有助于强化caco2细胞的运动能力(**P<0.01)。4.蛋白质双向电泳结果显示ANXA2基因敲除caco2细胞(KO)和野生型caco2细胞(WT)两组共有40个差异蛋白点,选择其中凝胶上所匹配蛋白点表达量的比值大于2,在同组三块平行凝胶图谱中都出现相同变化的15个差异蛋白点作为质谱分析的对象。与WT组相比,KO组中有11个蛋白质表达下调,4个蛋白质表达上调。将15个差异蛋白点的质谱分析指纹图案与NCBI蛋白质序列数据库(2015年1月更新)进行比对分析后,结果显示这15个蛋白分别是actin cytoplasmic 1 (ACTB)、actinin alpha 4 (ACTN4)、keratin type I cytoskeletal 10(KRT10;KBiP protein (HSPA5)、alpha-tubulin (a-tubulin)、mitochondrial heat shock 60kD protein 1 variant 1 (HSPD1)、thyroid hormone binding protein precursor (p55)、mitochondrial ATP synthase H+ transporting F1 complex beta subunit (ATP5B)、Human Enolase 1 (Henol)、Keratin 18 (KRT18)、Keratin 19 (KRT19)、cyclin-dependent kinase 7 (CDK7)、 alpha-tubulin (a-tubulin)、protein disulfide isomerase-related protein 5 (PDIA 5)、keratin 1 (KRT1)等,其中ANXA2基因敲除后共有11个蛋白表达下调,4个蛋白表达上调。5.以转录激活子样效应因子核酸酶(Transcriptional activator-like effector nucleases, TALEN)技术对tPA基因进行敲除的实验中,共获得10个细胞单克隆,测序分析比对结果显示所有单克隆均没有发生基因组序列突变,显示这十个细胞单克隆中没有tPA基因敲除成功的阳性克隆。经与国内同行沟通以及本室其他同学的实验结果分析,本次实验努力至少说明说明本研究所使用的从上海斯丹赛公司购买的TALEN试剂盒不易于对靶基因成功进行敲除。结论结果显示ANXA2基因与人结直肠癌caco2细胞的生长、增殖及运动能力密切相关。敲除ANXA2基因的表达可抑制caco2细胞的体外增殖力和迁移侵袭能力，提示ANXA2具有成为结肠癌基因治疗或药物治疗新靶点的潜在性。在此基础上进行的蛋白组学初步研究结果揭示结直肠癌caco2细胞中潜在的蛋白组学特点,为结直肠癌发生与发展过程中的蛋白相互作用机制的进一步探索以及相关基因功能的研究提供了新的理论和实验依据,并为ANXA2在CRC时的信号通路调节研究奠定了一定基础。利用从上海斯丹赛公司购买的TALEN试剂盒构建tPA基因敲除结直肠癌caco2细胞系未获得成功,说明该试剂盒不易对靶基因敲除成功,后续研究还需要进一步优化实验设计和条件。