急性肺损伤(acute lung injury,ALI)是指由心源性以外的各种肺内外致病因素导致的急性进行性缺氧性广泛的肺泡-毛细血管膜损伤。急性肺损伤ALI/急性呼吸窘迫综合征(ARDS ,严重的ALI)作为临床上的危重症,病死率高达40%～60%,至今还没有十分有效的治疗方法。革兰阴性菌(G-)细胞壁的主要成分脂多糖(1ipopolysaccharide,LPS)是ALI主要的致病因素,利用LPS复制ALI的动物模型进行研究是科研工作中的常用手段之一。一氧化氮(NO)由L-精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)作用下生成,是一种在细胞内和细胞间具有高度活性的信使小分子,广泛分布于体内。体内共有三种NOS同工酶。NO及其NOS与ALI病理变化有关,在内毒素性肺损伤的发生发展中起着很大的作用,并具有双重作用,不同来源的NO的作用各异,且相同来源的NO在病情的不同发病阶段作用不同,进一步探讨NO在肺损伤中的作用及其机制,为临床治疗肺损伤提供理论依据很有必要。本实验首先观察了在肺损伤病程中NOSmRNA表达的时程性变化及细胞凋亡率变化,在此基础上分别给予选择性NOS抑制剂氨基胍(Aminogunidine, AG)、非选择性NOS抑制剂NG-硝基-L-精氨酸(NG-nitro-L-arginine, L-NA)和NO的前提物质L-精氨酸(L-arginine,L-Arg),从内毒素性肺损伤的可能影响因素炎症细胞、炎症介质、肺泡上皮细胞损伤引起的肺表面活性物质(pulmonary surfaetant,PS)的改变和细胞凋亡等方面,从细胞、基因、蛋白水平多层次、多方面探讨NOS抑制剂在肺损伤中的作用及机制,为临床治疗肺损伤提供实验依据。第一部分LPS致大鼠肺损伤一氧化氮合酶和肺细胞凋亡变化目的:观察内毒素性肺损伤过程中肺细胞凋亡和一氧化氮合酶(NOS)mRNA表达的时程性变化及关系,探讨LPS性肺损伤(ALI)的发病机制。方法:健康雄性SD大鼠48只,随机分成2组:①对照组静注等量生理盐水;②模型组(LPS组):静注LPS复制ALI模型,分别于给药1h、3h、6h、9h及12h后采集样品;逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法测定肺组织中NOSmRNA表达变化;电镜、流式细胞术检测肺细胞凋亡率;免疫组化法测定Bcl-2和Bax;光镜、电镜观察肺组织病理变化。结果:1.正常对照组可见eNOS mRNA表达(0.288±0.017),LPS损伤后3h(0.234±0.005)开始在观察时间内随时间延长表达弱于对照组,与正常对照组比差异有显著性(P<0.05)。2.对照组iNOS mRNA极少量表达(0.081±0.002);给予LPS后即开始表达,损伤后3 h(0.206±0.006)与对照组有明显差异,并在观察时间内随时间延长表达明显增强(P﹤0.01)。3.对照组可见nNOS mRNA表达(0.147±0.013); LPS组在观察时间内与对照组没有明显差异。4. LPS组细胞凋亡率在观察时间内随着时间延长明显增加,LPS(3h)组(24.350±3.845)已明显高于对照组(11.373±3.088)(P<0.01),LPS(9h)组达到高峰(27.103±3.922),LPS(12h)组有所下降(21.683±3.153);光镜下观察Bcl-2和Bax蛋白阳性胞浆呈棕黄色染色,对照组可见Bcl-2和Bax蛋白阳性细胞表达(0.073±0.009)(0.076±0.010),主要在肺泡和支气管上皮细胞。炎性细胞也有表达,LPS组Bcl-2阳性细胞表达随时间延长逐渐减弱,3h、6h、9h,和12h时与对照组比较均有明显差异,Bax阳性细胞表达从损伤后3h(0.112±0.019)开始明显增加,Bcl-2/Bax(0.615±0.185)比值明显减小,与对照组有显著差异(P<0.01).5.电镜观察结果可见LPS组Ⅱ型肺泡上皮细胞微绒毛明显减少,嗜锇性板层小体数量减少,大部分空化,核染色质浓缩,体积小,电子密度升高,边集核膜下厚薄不均,局部形成半月状;线粒体轻度水肿,部分嵴排列紊乱,数量减少,部分嵴和核膜融合或消失,粗面内质网有脱颗粒现象,随时间延长病变加重。结论:不同一氧化氮合酶在ALI中表达强度不同;抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax是ALI时调节细胞凋亡的途径之一;一氧化氮合酶可能通过调节Bcl-2和Bax平衡而影响凋亡。第二部分氨基胍对大鼠内毒素性肺损伤的影响目的:观察选择性一氧化氮合酶抑制剂氨基胍(AG)对大鼠内毒素性肺损伤(ALI)的影响,探讨AG对肺损伤组织的保护作用及其机制。方法:健康雄性SD大鼠,随机分为:①对照组;②模型组(LPS组);③AG治疗组。其中LPS组和AG治疗组按治疗时间又分为给LPS 1h后治疗3h(1h+3h)、LPS 3h后治疗3h(3h+3h)组和给LPS 6h后治疗3h(6h+3h)组,AG治疗组分别于给LPS1h、3h和6h后给AG(100mg/kg),ip给药,LPS组给等量的生理盐水;1h+3h组于注射LPS 4h后处死大鼠;3h+3h组于注射LPS 6h后处死大鼠; 6h+3h于注射LPS 9h后处死大鼠,每组8只动物。模型组、AG治疗组iv注射LPS复制内毒素性肺损伤大鼠模型,对照组给等量生理盐水。光镜、电镜观察肺组织病理变化;放射免疫法分别测定肺组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)的含量;免疫组化染色分析肺组织中粘附分子-1(ICAM-1)表达和NF-κB的核移位;原位杂交法(ISH)测定SP-A mRNA表达;免疫组化法测定Bcl-2和Bax蛋白的表达;Western blot法检测caspase-3蛋白的表达;电镜、流式细胞术(FCM)检测肺细胞凋亡率。结果:1.电镜下观察肺组织超微结构:LPS组Ⅱ型肺泡上皮细胞微绒毛明显减少,嗜锇性板层小体数量减少,大部分空化,核染色质浓缩,体积小,电子密度升高,边集核膜下厚薄不均,局部形成半月状;线粒体轻度水肿,部分嵴排列紊乱,数量减少,部分嵴和核膜融合或消失,粗面内质网有脱颗粒现象,随时间延长病变加重,AG各组上述病变明显减轻,AG(1h+3h)组最为显著。2.与对照组相比,LPS组NF-κB活化,明显从细胞浆移位于细胞核,表达量也显著增加(P﹤0.01);肺组织中TNF-α、IL-6含量明显升高(P﹤0.01,P﹤0.05),其中LPS(1h+3h)组最高,随后在观察时间内呈下降趋势;LPS组血管内皮细胞、肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞和巨噬细胞ICAM-1蛋白表达呈深棕色颗粒状强阳性染色。(与对照组相比,P﹤0.01)。与LPS组比较,AG(1h+3h)和AG(3h+3h)组NF-κB从细胞浆向细胞核的移位被明显限制,NF-κB的表达量也明显低于LPS组(P﹤0.01),肺组织中TNF-α、IL-6含量明显低于相应的LPS组(P﹤0.01, P﹤0.05),组肺组织ICAM-1蛋白表达减少(P﹤0.01)。3.正常对照组大鼠肺内SP-A mRNA(0.113±0.208)表达丰富,主要分布于肺泡Ⅱ型细胞及部分肺泡巨噬细胞内,呈棕黄色颗粒,肺泡及细支气管腔内也有一薄层棕黄色物;LPS组SP-A mRNA表达明显减低,颜色明显变淡,且在观察时间内随时间增加呈下降趋势,与LPS组比较,AG(1h+3h)组(0.098±0.013)和AG(3h+3h)组(0.082±0.020)SP-A mRNA阳性细胞表达有所增强,分别为P﹤0.01, P﹤0.05。4.对照组可见Bcl-2和Bax蛋白阳性细胞,与对照组比较,LPS组Bcl-2蛋白表达有所减弱,Bax蛋白表达明显增强,Bcl-2 /Bax降低( P<0.01);与LPS组比较,AG(1h+3h)、AG(3h+3h)和AG(6h+3h)组Bcl-2阳性细胞表达(0.076±0.009,0.073±0.008,0.065±0.010)有所增强,Bax阳性细胞表达明显减弱,Bcl-2 /Bax增加( P<0.01)。正常对照组仅有少量的caspase-3(110.24±14.35)的表达,LPS组caspase-3蛋白表达较对照组明显增强(P﹤0.01);与LPS组比较,AG(1h+3h)和AG(3h+3h)组caspase-3蛋白表达(177.62±22.29,189.17±14.98)明显减弱(P<0.01); AG(6h+3h)组caspase-3蛋白表达和LPS组比较没有明显变化。LPS组细胞凋亡率较对照组明显增加,AG(1h+3h)、AG(3h+3h)组细胞凋亡率(14.96±2.46,15.00±2.52)显著低于LPS组(P<0.01,P<0.05),AG(6h+3h)组细胞凋亡率与LPS组比较没有明显变化。结论:在ALI较早期应用AG能明显抑制NF-κB的活化,下调TNF-α、IL-6、ICAM-1等炎症相关因子的表达;增强SP-A mRNA表达;同时增强Bcl-2蛋白表达、减弱Bax蛋白表达、调节Bcl-2蛋白/Bax蛋白平衡;抑制caspase-3表达和肺细胞凋亡,从而减轻肺损伤。第三部分L-NA对大鼠内毒素性肺损伤的影响目的:观察非选择性一氧化氮合酶抑制剂NG-硝基-L-精氨酸(NG-nitro-L-arginine, L-NA)对大鼠内毒素性肺损伤(ALI)的影响,探讨L-NA对肺损伤组织的保护作用及其机制。方法:健康♂SD大鼠,随机分为:①对照组;②模型组(LPS组);③L-NA治疗组。其中LPS组和L-NA治疗组按治疗时间又分为给LPS 1h后治疗3h(1h+3h)、LPS 3h后治疗3h(3h+3h)组和给LPS 6h后治疗3h(6h+3h)组,L-NA治疗组分别于给LPS 1h、3h和6h后给L-NA(20mg/kg),ip给药,LPS组给等量的生理盐水;1h+3h组于注射LPS 4h后处死大鼠;3h+3h组于注射LPS 6h后处死大鼠; 6h+3h于注射LPS 9h后处死大鼠,每组8只动物。模型组、L-NA治疗组iv注射LPS复制内毒素性肺损伤大鼠模型,对照组给予等量生理盐水。光镜、电镜观察肺组织病理变化;放射免疫法分别测定肺组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)的含量;免疫组化染色分析肺组织中粘附分子-1(ICAM-1)表达和NF-κB的核移位;原位杂交法(ISH)观察SP-A mRNA表达;免疫组化法测定Bcl-2和Bax蛋白的表达;Western blot法检测caspase-3蛋白的表达;电镜、流式细胞术(FCM)检测肺细胞凋亡率。结果:1.电镜下观察肺组织超微结构:LPS组Ⅱ型肺泡上皮细胞微绒毛明显减少,嗜锇性板层小体数量减少,大部分空化,核染色质浓缩,体积小,电子密度升高,边集核膜下厚薄不均,局部形成半月状;线粒体轻度水肿,部分嵴排列紊乱,数量减少,部分嵴和核膜融合或消失,粗面内质网有脱颗粒现象,随时间延长病变加重,L-NA(3h+3h)组上述病理改变有所减轻。2.与对照组相比,LPS组NF-κB活化,明显从细胞浆移位于细胞核,表达量也显著增加(P﹤0.01);肺组织中TNF-α、IL-6含量明显升高(P﹤0.01),其中LPS(1h+3h)组最高(0.083±0.015,72.03±9.72),随后在观察时间内呈下降趋势;LPS组血管内皮细胞、肺泡上皮细胞、支气管上皮细胞和巨噬细胞ICAM-1蛋白表达呈深棕色颗粒状强阳性染色(与对照组相比P﹤0.01)。与LPS组比较,L-NA(1h+3h)和L-NA(3h+3h)组NF-κB从细胞浆向细胞核的移位被明显限制,NF-κB的表达量(31.47±11.76,31.70±6.63)也明显低于LPS组(P﹤0.05, P﹤0.01),L-NA(1h+3h)和L-NA(3h+3h)组肺组织ICAM-1蛋白表达(0.088±0.014,0.072±0.009)减少(P﹤0.05, P﹤0.01),L-NA各治疗组TNF-α、IL-6含量和LPS组比较没有明显差异。3.正常对照组大鼠肺内SP-A mRNA(0.113±0.208)表达丰富,主要分布于肺泡Ⅱ型细胞及部分肺泡巨噬细胞内,呈棕黄色颗粒,肺泡及细支气管腔内也有一薄层棕黄色物;LPS组SP-A mRNA表达明显减低,颜色明显变淡,且在观察时间内随时间增加呈下降趋势,与LPS组比较,L-NA(1h+3h)组(0.096±0.013)和L-NA(3h+3h)组(0.085±0.015)SP-A mRNA阳性细胞表达有所增强,分别为P﹤0.05, P﹤0.01。4.对照组可见Bcl-2和Bax蛋白阳性细胞,与对照组比较,LPS组Bcl-2蛋白表达有所减弱,Bax蛋白表达明显增强,Bcl-2 /Bax降低( P<0.01);与LPS组比较, L-NA(3h+3h)、L-NA(6h+3h)组Bcl-2阳性细胞表达(0.070±0.087,0.064±0.010)有所增强,但各治疗组Bax和Bcl-2 /Bax没有明显变化。正常对照组仅有少量的caspase-(3110.24±14.35)的表达,LPS各组caspase-3蛋白表达较对照组明显增强(P﹤0.01);与LPS组比较,L-NA各治疗组caspase-3蛋白表达和LPS组比较没有明显差异。LPS组细胞凋亡率较对照组明显增加(P<0.01);L-NA(1h+3h)组细胞凋亡率低于LPS组(P<0.05),L-NA(3h+3h)和L-NA(6h+3h)组与LPS组没有明显差异。结论:ALI时给予L-NA,能抑制肺损伤时NF-κB的活化,减弱ICAM-1的表达,增强SP-A mRNA的表达,在一定程度上减轻了肺损伤,且LPS3h后给药效果优于LPS1h后给药,但对促炎细胞因子TNF-a和IL-6、Bax蛋白表达、Bcl-2 /Bax、caspase-3表达和细胞凋亡没有影响。第四部分氨基胍和L-精氨酸对LPS诱导的大鼠肺泡巨噬细胞的影响目的:观察选择性一氧化氮合酶抑制剂氨基胍(AG)和一氧化氮(NO)前体物质L-精氨酸(L-Arg)对LPS诱导的巨噬细胞的作用并探讨可能的机制。方法:采用健康雄性SD大鼠,肺泡灌洗,分离纯化肺泡巨噬细胞,随机分为4组,每组8孔,给予LPS和各种药物,分别为①空白组:不加任何药物;②LPS组(终浓度10μg/ml);③AG组(LPS+AG,2mmol/L);④L-Arg(LPS+ L-Arg,2mmol/L),③④组无血清培养基中除含终浓度为10μg/ml的LPS外,同时分别加入AG和L-Arg,终浓度均为2mmol/L,用无血清的DMEM培养基置37℃、5%CO2培养箱培养3h。分光光度计法检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)的活性和NO的浓度;四唑盐比色法(MTT)检测细胞线粒体活性;放射免疫法测定细胞上清液中TNF-α和IL-6的含量。结果:1.与正常对照组相比, 10μg/ml的LPS处理巨噬细胞3h后,细胞培养上清中LDH(181.54±22.81)释放明显增多(P﹤0.01);NO浓度(765.69±32.14)也明显增高(P﹤0.01);细胞线粒体活性(0.450±0.041)降低;TNF-a和IL-6浓度(542.52±70.11, 162.12±33.14)明显高于对照组(P﹤0.01);AG可明显减少LPS所致的LDH(133.97±35.99)和NO(588.63±97.43)的释放(P﹤0.05,P﹤0.01),增加线粒体活性(0.571±0.099)(P﹤0.01),降低TNF-a(306.13±44.14)和IL-6(133.08±13.73)浓度(P﹤0.01,P﹤0.05)。2.与LPS组相比,L-Arg减少LDH释放(136.93±30.41)(P﹤0.05),增加线粒体活性(0.556±0.039)(P﹤0.01),降低TNF-a和IL-6浓度(277.57±40.50,130.73±16.61)(P﹤0.01,P﹤0.05),但对LPS所致NO浓度的升高没有作用。结论:LPS可刺激离体肺泡灌洗液中巨噬细胞分泌促炎因子和NO,并降低了细胞线粒体活力,增加了细胞膜的通透性;AG和L-Arg可通过不同的机制在一定程度上抑制LPS对细胞的作用。