重症肌无力(MG)是一种神经-肌肉接头传递障碍的疾病,多数患者血清中存在抗神经-肌肉接头突触后膜乙酰胆碱受体(AChR)的自身抗体。长久以来,相关自身抗体诱导的自身免疫损伤被认为是MG的主要发病机制；这种认识的合理性和指导意义已在多年临床诊治实践中被反复地论证。然而,要追溯患者自身免疫的源头,或试图阐述不同个体(如有些患者血清乙酰胆碱受体自身抗体阴性,有些患者血清中有多种自身抗体的存在等)的病理生理机制,或要解释首发病灶的相对选择性,以及寻求解释MG患者受累肌肉的易疲劳性,很难用自身免疫损伤理论进行合理的充分阐述。是不是还存在其他的病理改变被忽略导致了上述的困惑?就现有的认识而言,MG骨骼肌是受累部位及各种免疫损伤作用的靶点,骨骼肌的各种结构蛋白质和功能蛋白质是它发挥和执行各种生理功能的物质基础。因此,了解MG骨骼肌蛋白质的变化进而筛选鉴定与MG相关的蛋白质(疾病相关蛋白),这无论对加深MG病理生理机制的认识还是作为对现有自身免疫损伤理论的补充都有十分重要的意义。在以前的研究中,发现了MG患者骨骼肌中的碳酸酐酶Ⅲ(EC4.2.1.1,CAⅢ)蛋白和mRNA表达水平均明显低于其他非MG肌病患者及正常个体。　　 由于骨骼肌CAⅢ蛋白水平的下降必定伴随其功能的下调,因此,为进一步探讨CAⅢ与MG的关系,CAⅢ生理功能的了解就至关重要。然而,目前对CAⅢ的生理功能还没有明确的认识,对它在不同的病理状况下发生的改变和改变的意义更是知之甚少。已有研究发现CAⅢ具有磷酸酶的活性,并认为CAⅢ可能涉及了细胞的信号传导、氧化应激、和凋亡等。不幸的是,目前对CAⅢ的磷酸酶活性存有争议,有研究指出CAⅢ并不具有内在的磷酸酶活性,而是在分离纯化过程中有一个污染的蛋白磷酸酶成分所致。从以往本课题一系列的研究结果曾推测:CAⅢ缺乏可能与MG骨骼肌的易疲劳和收缩无力有关。如若CAⅢ具有磷酸酶功能,势必对上述的推测甚至对MG的病理机制认识具有极大的启迪与帮助,因此,论证CAⅢ究竟是否具有内在的磷酸酶活性对进一步了解MG十分关键。　　 同时目前的观点认为,MG骨骼肌的活动无力和易疲劳性是神经-肌肉接头处神经冲动传递受阻所导致。基于骨骼肌的特性同时受神经支配和自身活动(活动依赖性和活动非依赖性)因素的共同调控,那么MG患者骨骼肌中的CAⅢ减少是否与神经冲动传导受阻或其所致的骨骼肌活动减少有关呢?阐明此问题势必有助于认识骨骼肌CAⅢ表达减少与MG的关系以及这种改变对疾病的意义。　　 第一部分碳酸酐酶Ⅲ磷酸酶活性的论证　　 目的:探讨碳酸酐酶Ⅲ CAⅢ是否本身具有磷酸酶活性。方法:采用双向电泳结合Western Blot方法将分离的骨骼肌蛋白转移至硝酸纤维膜,利用镜像原理,识别与CAⅢ抗体发生免疫反应的抗原在双向电泳图谱中的确切位置。在此基础上,以同样的方法与原理对转移至固相膜上的骨骼肌蛋白进行磷酸酶活性原位染色,观察CAⅢ是否染色。此外,通过磷酸酶抑制剂实验及酶催化反应动力学实验,论证CAⅢ的磷酸酶活性染色特异性及CAⅢ的磷酸酶催化功能。结果:CAⅢ抗体反应显示,利用镜像原理能从复杂的双向电泳图谱中容易地识别CAⅢ蛋白；磷酸酶活性染色表明,鉴定的CAⅢ具有磷酸酶活性。磷酸酶特异抑制剂实验表明,CAⅢ的磷酸酶活性染色具有特异性；酶催化反应动力学研究证实,CAⅢ蛋白具有确凿的磷酸酶功能。结论:骨骼肌的CAⅢ本身具有磷酸酶活性,可能参与细胞的磷酸化-去磷酸化过程。这提示MG时可能涉及了骨骼肌细胞氧化应激改变或细胞信号转导缺陷等。　　 第二部分去神经对碳酸酐酶Ⅲ表达和磷酸酶活性的影响　　 目的:探讨神经冲动对CAⅢ表达和磷酸酶活性的影响。方法:定向切断支配大鼠趾长伸肌(EDL,主要由快肌纤维组成)和比目鱼肌(Soleus,Sol,主要由慢肌纤维组成)的神经,设定术后第7d、第14d、第28d、第56d4个时间点以了解近期和相对长期的变化,采用免疫印迹半定量分析骨骼肌CAⅢ蛋白质水平的变化,SDS-PAGE后固相膜上原位酶活性分析评估CAⅢ磷酸酶活性的变化。结果:就骨骼肌中CAⅢ水平而言,无论是去神经侧还是对侧,Sol的CAⅢ水平远高于EDL,且两者的CAⅢ水平都表现出随时间(动物年龄)的变化而逐渐上调,这种趋势在Sol中较EDL骨骼肌中更为明显。去神经后,EDL的CAⅢ水平表现为随去神经后时间的延长而持续增加；但Sol的CAⅢ水平表现出去神经后14d明显增加而后明显降低,在去神经28d与去神经对侧没有差别,在56d低于对侧。对快慢肌CAⅢ磷酸酶活性而言,无论是去神经侧还是对侧,Sol的CAⅢ磷酸酶活性均要高于EDL。在正常侧(即去神经对侧),Sol的CAⅢ磷酸酶活性表现为随时间(动物年龄)的变化而逐渐上调的趋势,而在EDL没有明显的随时间变化。去神经后Sol的CAⅢ磷酸酶活性较对侧下降且随观测时间的延长而逐渐下调,EDL则在去神经后14d时CAⅢ磷酸酶活性增加后即呈现明显的降低。结论:骨骼肌CAⅢ表达及其磷酸酶活性受神经支配的影响。去神经后,快慢肌中CAⅢ蛋白量增加而磷酸酶活性却显著下降；这种蛋白量改变与酶活性变化不一致的现象可能与神经-肌肉的兴奋-收缩耦联及营养关系破坏后骨骼肌出现去分化有关。　　 第三部分去肌腱对碳酸酐酶Ⅲ表达和磷酸酶活性的影响　　 目的:探讨肌肉运动对碳酸酐酶Ⅲ表达和磷酸酶活性的影响。方法:定向切断大鼠趾长伸肌EDL和比目鱼肌Sol的远端肌腱,设定术后第7d、第14d、第28d、第56d4个时间点以了解近期和相对长期的变化,采用免疫印迹定量分析两组骨骼肌CAⅢ蛋白水平的变化,固相膜上原位酶活性分析评估CAⅢ磷酸酶活性的变化。结果:免疫印迹结果显示对照侧(手术对侧)SOL、EDL的CAⅢ都表现出随观察时间(年龄)的延长而逐渐上调,这种趋势在SOL较EDL明显。在去肌腱术后,SOL与EDL中CAⅢ蛋白水平都较对侧升高且都表现出随术后时间增加而逐渐上升的趋势。就相对变化幅度看,SOL在28d最高较对侧增加了53.4％,EDL CAⅢ蛋白量28d则增加了1倍。尽管在去肌腱后快慢肌CAⅢ磷酸酶活性都显著降低,但磷酸酶活性的变化与蛋白变化一致。比较术后SOL、EDL CAⅢ磷酸酶活性改变,发现SOL的CAⅢ磷酸酶活性下降最为显著,在观察终点时仅占对照侧的10％；而在所有观察时间点EDL的CAⅢ磷酸酶活性都维持在对照侧的60％左右。结论:骨骼肌CAⅢ表达及其磷酸酶活性与骨骼肌的主动运动和运动模式有关。当骨骼肌主动运动不能时(运动模式改变),快慢肌中CAⅢ蛋白量增加(以快肌为甚)而磷酸酶活性显著下降(以慢肌为甚)；这种蛋白量改变与酶活性变化分离的现象可能与去肌腱后骨骼肌的主动收缩活动不能、代谢水平下降有关,即CAⅢ与骨骼肌执行主动收缩活动有关。