shRNA沉默TPX2基因对肺腺癌细胞A549凋亡及紫杉醇敏感性的影响

来源 :重庆医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:xianglikai
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目的:观察靶向Xklp2靶蛋白(the targeting protein for Xenopuskinesin-like protein2,TPX2)的短发夹状RNA(short hairpin RNA, shRNA)对肺腺癌A549细胞的凋亡率及其对化疗药物敏感性的影响。方法:以肺腺癌A549细胞做为实验的研究对象。构建特异性靶向TPX2基因的干扰载体shRNA-TPX2,经Lipofectamine2000介导将shRNA-TPX2干扰载体转染进入A549细胞,并进行筛选及克隆化培养。逆转录RCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)及蛋白质印迹法(Western blotting)分别检测转染干扰载体前后细胞中TPX2基因mRNA和蛋白表达水平的变化。细胞凋亡率及细胞周期的变化用流式细胞术检测。MTT比色法用于检测对化疗药物敏感性的变化。RT-PCR检测Aurora-A, P53,Bcl-2,肺耐药蛋白(lung resistance protein, LRP)及多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein,MRP)mRNA表达水平的变化。结果:RT-PCR及Western blotting结果显示,shRNA-TPX2重组质粒能使A549细胞中TPX2mRNA及蛋白表达水平明显降低;流式细胞术结果显示转染组的细胞凋亡率明显增高且阻滞在细胞周期S期;MTT比色法结果显示转染了重组质粒shRNA-TPX2的A549细胞对化疗药物紫杉醇的敏感性明显增加;RT-PCR检测相关基因显示P53mRNA表达水平升高,Aurora-A,Bcl-2mRNA表达水平降低。以上实验结果经统计学分析与阴性对照组,空白对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);而LRP,MRP mRNA表达水平与各个对照组相比并未见明显改变(P>0.05)。结论:重组质粒能在核酸水平和蛋白水平上有效的抑制肺腺癌细胞系A549中TPX2基因的表达。并且促进细胞的凋亡,增加其对化疗药物紫杉醇的敏感性。该作用可能与TPX2基因被抑制后,其下游P53表达水平上调,Bcl-2表达水平下调有关。
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