【摘 要】
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目的:设计、合成多房棘球蚴多表位疫苗GILE,构建GILE原核表达系统,通过该系统表达、纯化GILE重组蛋白,并通过动物实验研究多表位疫苗GILE的免疫原性及免疫保护作用。方法:1.结合课题组前期对多房棘球蚴EMY162、LAP、GLUT1优势抗原表位鉴定的结果,使用SWISS-MODEL、py MOL、SOPMA、VMD生物信息学软件预测GILE的空间结构舒展性及疏水性,设计多表位疫苗GILE。
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目的:设计、合成多房棘球蚴多表位疫苗GILE,构建GILE原核表达系统,通过该系统表达、纯化GILE重组蛋白,并通过动物实验研究多表位疫苗GILE的免疫原性及免疫保护作用。方法:1.结合课题组前期对多房棘球蚴EMY162、LAP、GLUT1优势抗原表位鉴定的结果,使用SWISS-MODEL、py MOL、SOPMA、VMD生物信息学软件预测GILE的空间结构舒展性及疏水性,设计多表位疫苗GILE。2.使用OptimumTM Codon软件依据大肠杆菌密码子的偏好性对GILE基因序列进行优化。将合成的GILE基因序列插入质粒p Czn1中,构建重组质粒p Czn1-GILE。将重组质粒转化入大肠杆菌Artic express中,添加IPTG诱导重组蛋白表达并通过亲和层析法获得高纯度重组蛋白GILE。3.使用GILE重组蛋白混合弗氏佐剂免疫BALB/c小鼠,免疫结束后,收集小鼠血清。通过ELISA法检测小鼠Ig G水平并对其变化情况进行动态检测,通过MTS法评估小鼠脾脏淋巴细胞增殖情况,通过ELISpot法和流式细胞术评估IFN-γ、IL-4分泌情况。4.免疫结束后进行攻毒实验,分离小鼠腹腔中囊泡,统计重量并通过流式细胞术检测CD4+和CD8+T淋巴细胞,评价疫苗的免疫保护作用。结果:1.通过SWISS-MODEL软件开展同源建模,结果表明抗原表位最优串联方式为EMY16295-104―LAP464-479―LAP495-510―LAP396-410―EMY162106-121―LAP504-518―EMY162112-126。2.通过SOPMA软件分析GILE的二级结构,结果表明α螺旋比例占13.84%、β折叠比例占26.25%、β转角比例占14.88%,无规卷曲比例占45.82%。3.通过酶切和测序验证,结果表明质粒p Czn1-GILE构建成功。4.添加IPTG,得到44.68 KD的目的重组蛋白。5.通过固化金属离子亲和色谱法得到纯化重组蛋白GILE。通过Western Blot法验证,纯化后的GILE蛋白能与His抗体特异结合,得到纯化重组蛋白GILE。6.通过ELISA检测,结果表明与对照组相比,GILE免疫组的小鼠产生了较高水平的血清抗体。7.通过流式细胞术和ELISpot检测,结果表明GILE免疫组的小鼠分泌了较多的IFN-γ和IL-4。8.通过流式细胞术检测,结果表明GILE免疫组的小鼠产生了较多的CD4+和CD8+T淋巴细胞。9.GILE组囊泡重量小于对照组及单一抗原肽免疫组。结论:本研究通过生物信息学软件成功设计、构建了多表位疫苗GILE,并通过GILE原核表达系统表达、纯化了重组蛋白GILE。通过动物实验对GILE进行验证,结果表明多房棘球蚴多表位疫苗GILE具有良好的免疫原性。本课题的开展将为多房棘球蚴病的防治及传染源的防控提供新理论依据和实验基础。
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