大肠杆菌(Escherichia coli)因易培养繁殖和遗传背景清楚被选为实验室模式菌株用于分子生物学、生物工程和代谢组学等学科的研究。代谢物组学是对菌体胞内外的小分子代谢物进行定性和定量研究的基础,本研究对大肠杆菌JM109在不同营养层次的生长进行了研究,重点研究了在不同情况下氨基酸吸收利用情况。其目的是分析氨基酸的利用和转化,了解大肠杆菌的氨基酸代谢特点,为在此基础上改进培养基以促进菌体的生长发酵性能和设计转化路径研究做准备。在研究中,还对合成GABA的产酶和酶活性调控为模型进行代谢控制现象水平研究。建立一套完整的氨基酸代谢检测方法。优化一套适用的FMOC-Cl衍生氨基酸参数:样品40μL、0.2 mol/L氨基酸衍生缓冲液40μL、FMOC-Cl溶液20μL、乙腈80μL、去离子水90μL,室温放置10 min;建立一套合适淬灭菌株和通透细胞膜的方法,为后续胞内物质检测分析奠定了基础;建立HPLC-MS检测代谢物的方法和氨基酸标准曲线,准确对氨基酸进行定性和定量分析。在LB中共鉴定出14种氨基酸:Arg 0.249 g/L、Glu 0.031 g/L、Gly 0.218g/L、Ala 0.035 g/L、Pro 0.040 g/L、Met 0.007 g/L、Ser 0.042 g/L、Val 0.043 g/L、Trp 0.014 g/L、Leu/Ile 0.144 g/L、Phe 0.094 g/L、Lys 0.080 g/L、Thr 0.024 g/L;大肠杆菌JM109(p UC19)在LB培养基标准条件下生长后氨基酸消耗:Arg 100%、Gly 47%、Ala 100%、Met 100%、Leu/Ile 31%、Lys 52%,Pro 100%、Thr 100%、Ser 100%、Trp 100%、Glu 100%;氨基酸产生:Val 12%、Phe 12%;细胞内五种氨基酸积累:Glu、Ala、Val和Leu/Ile,细胞内外对比发现,大肠杆菌对Glu和Ala有很强大的向胞内主动运输能力。大肠杆菌主要以单一氨基酸作为氮源培养时,结果表明:Glu和Asp被菌株较好利用,且菌株长势很好;Cys、Tyr、Val培养时产生较高浓度新物质,菌株生长状态差;Trp和Pro进行培养时,菌株生长后变酸,菌株生长情况一般,剩余量很高;His、Thr和Gly发酵后剩余量较多,但是菌体量却很高,尤其是His,剩余40%以上,其生长量比一般氨基酸高50%以上,显示可能存在特殊生理机理。根据细胞剩余情况,在今后大肠杆菌代谢路径设计中,在简单培养基上,Glu、Phe、Pro、His、Thr和Gly可能比较适合于作为生物转化出发物;在富营养条件下,Glu、Ala、Val、Leu、Ileu以及Gly、Phe和Lys可能比较适合于作为生物转化出发物。在LB培养基中不同p H条件下:胞外氨基酸Ser、Thr、Pro和Trp全部耗尽;Glu在不同p H下完全耗尽,胞内保留较高浓度;Leu/Ile在p H 5.52时,胞内积累量最高,胞外量最低;Arg在p H 4.58时,吸收受阻;Val和Phe属于产出氨基酸,随着p H升高胞外量越高。在LB培养基中不同温度条件下:胞外氨基酸Ser、Thr、Pro和Trp全部耗尽;Glu在不同温度下完全耗尽,胞内保留较高浓度;Val和Phe属于产出氨基酸,随着温度改变胞外产生量越高;Gly在35℃情况下,吸收受阻。用同尾酶Sau 3A1和Bam HI构建随机文库,筛选显著改变代谢途径的菌株,最后发现产生一种新物质的17号菌株,通过基因测序证明含有天冬氨酸脱羧酶,质谱鉴定产物应为β-羟基丙酸(3-AP)。但有意思的是17号菌株产生3-AP仅存在于LB培养基条件下,在转化Asp培养基中反而并没有产生。有可能存在某种调控机制,有待进一步分析研究。大肠杆菌转化Glu产生GABA为模型的研究中发现,(1)GABA转化产量显著受p H影响,p H 2.6比p H 7.2产量高40倍;(2)在LB培养基产生大量的谷氨酸脱羧酶,而在GI培养基中产生量减少93%以上;(3)谷氨酸脱羧酶活性在含葡萄糖的转化液中活力比在LB中高15倍(p H 2.6);(4)在LB培养基加入5 g/L葡萄糖培养菌体时产生的谷氨酸脱羧酶量下降76%;(5)大肠杆菌在酸性和中性LB发酵培养基培养9 h,都产生了大量而且等量的谷氨酸脱羧酶。基于这些现象,可以洞察到大肠杆菌转化Glu产生GABA的复杂调控机制,酶产生和酶活力的调控都非常显著,现有理论无法完全解释。这些研究结果为我们深入研究大肠杆菌的代谢调控机理提供了一个有价值的窗口。