论文部分内容阅读
当前,环境雌激素的危害问题已引起人们极大的关注。许多研究证实,环境雌激素对动物具有内分泌干扰效应,能明显降低生殖功能[1,2]。甲氧滴滴涕(MXC)是一种替代滴滴涕的有机氯杀虫剂,在体内可被转化为具有雌激素活性的代谢物[3]。被广泛用于杀灭农作物和室内的害虫。与DDT相比,MXC具有毒性低、代谢快、在脂肪组织中不易蓄积等优点[4]。然而研究表明,MXC对动物的生育具有毒性作用,包括阻止胚胎着床[5,6,7],但MXC抑制胚胎着床的机制尚待深入研究。钙结合蛋白D9k(Calbindin-D9k)是一种分子量为9kD的钙结合蛋白,属于细胞内的蛋白家族。子宫Calbindin-D9k因与细胞内的钙水平密切相关,认为其可控制子宫肌层的活动[8]。此外,有证据表明,在胚胎植入的早期阶段必需有Calbindin-D9k的存在,它对胚胎的成功植入发挥至关重要的作用[9]。研究发现,未成熟雌性大鼠体内暴露环境雌激素,如MXC,可引起子宫Calbindin-D9k的表达显著上升,并呈剂量依赖关系,因此Calbindin-D9k可被用作检测环境雌激素类化学物雌激素活性的生物标志物,然而,有关MXC对胚胎着床期Calbindin-D9k表达的影响的研究十分缺乏。本课题的目的是通过使用MXC染毒孕小鼠作为实验动物模型,探讨MXC对孕小鼠子宫雌激素受体α亚型(ERα)、孕激素受体(PR)表达的影响以及对小鼠妊娠率及胚胎着床数的影响。同时,进一步深入研究MXC染毒对孕小鼠子宫Calbindin-D9k mRNA和蛋白表达的影响,揭示MXC抑制胚胎着床的分子机制。本实验分为两个部分。第一部分:构建MXC染毒孕小鼠模型,观察MXC对胚胎着床及子宫ERα、PR表达的影响。八十只交配成功的雌小鼠被随机分配到4个组,每组20只。其中3个MXC处理组小鼠从孕1d(发现阴栓定为孕0d)起给予MXC灌胃染毒,每天1次,连续3d,剂量分别为低剂量组(100 mg/kg),中剂量组(200 mg/kg),高剂量组(400mg/kg),MXC溶解在芝麻油中给药。对照组小鼠只灌芝麻油溶剂。至孕5d处死孕鼠,迅速分离出子宫并观察各组小鼠妊娠率及胚胎着床数。采用RT-PCR检测子宫ERα、PR mRNA表达,免疫组织化学与图像分析技术检测子宫ERα、PR蛋白表达。结果:①孕小鼠经MXC灌胃3 d后,高、中剂量MXC组孕小鼠的妊娠率与对照组相比显著降低(P<0.05),低剂量MXC组孕小鼠的妊娠率与对照组相比降低无明显差异;②高、中剂量MXC组孕小鼠平均胚胎着床数与对照组相比显著降低(P<0.01),然而,低剂量组孕小鼠胚胎着床数虽然有所降低,但无统计学意义。③随着MXC染毒剂量的增加,孕小鼠子宫ERαmRNA与蛋白的表达量相应增加,高、中剂量组ERαmRNA与蛋白的表达与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);④高、中剂量组孕小鼠子宫PR mRNA的表达较对照组显著降低(P<0.05),低剂量组PR mRNA的表达未见明显变化,PR蛋白表达的变化与PRmRNA的变化一致。第二部分:MXC对孕早期小鼠子宫Calbindin-D9k基因表达的影响实验动物染毒模型构建同实验一。采用RT-PCR检测Calbindin-D9k mRNA表达,Western blot和免疫组化染色法检测Calbindin-D9k蛋白表达。结果:当孕鼠暴露MXC 3 d后,高、中剂量组Calbindin-D9k mRNA的表达量与对照组相比显著降低(P<0.05),然而,低剂量组Calbindin-D9k mRNA的表达与对照组相比降低不明显(P>0.05)。Calbindin-D9k蛋白在孕5 d主要表达在子宫内膜上皮细胞和腺上皮细胞。与mRNA的表达水平相应,高、中剂量组Calbindin-D9k蛋白的表达量与对照组相比显著降低(P<0.05),而低剂量组与对照组相比无明显差异(P>0.05)。结论:综合以上结果,我们得出如下结论:①MXC染毒可明显降低孕小鼠的妊娠率及胚胎着床数,抑制胚胎着床作用与MXC染毒剂量呈正相关性。②MXC通过其弱雌激素活性和拮抗孕激素作用,上调孕小鼠子宫ERαmRNA及蛋白表达,同时下调PR mRNA及蛋白表达,说明MXC可干扰孕小鼠体内雌、孕激素正常环境,抑制胚胎着床。③胚胎着床早期Calbindin-D9k参与调节着床点钙的利用及控制子宫肌层的活动,对胚胎稳定着床发挥重要作用。MXC染毒降低着床期孕小鼠子宫Calbindin-D9k mRNA及蛋白表达,其下调水平与MXC染毒剂量呈正相关性。④MXC染毒下调孕小鼠子宫Calbindin-D9k表达的同时,PR mRNA及蛋白表达下降,证实小鼠子宫Calbindin-D9k受孕激素调节的理论,MXC降低孕小鼠子宫Calbindin-D9k的表达,可能是其抑制胚胎着床机制中的一个重要环节。