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菊三七Gynura japonica（Thunb.）Juel.是我国民间常用中草药,又名土三七,具止血、活血化瘀等功效.又因其根茎与五加科三七属植物三七Panax notoginseng（Burk.）F.H.Chen极为相似,因此常被误服或误用。特别是近年来,因误服菊三七导致肝窦阻塞综合征（Hepatic sinusoidal obstruction syndrome,HSOS）的事件频发,引起了国际对中药安全性的广泛关注。研究表明,吡咯里西啶生物碱（pyrrolidine alkaloids,PAs）,如千里光碱（senecionine）,是菊三七导致HSOS的主要毒性成分。PAs在肝脏中代谢活化后,发生一系列的生物转化,对肝脏造成严重的损伤。而PAs分布广泛,存在于世界上6000多种植物中,国外也有大量因PAs暴露导致严重肝损伤的报道。弄清楚PAs的肝毒性和其致毒机制的研究不仅是我国亟待解决的问题,国际上也引起了极大的关注。然而由于PAs引起的肝毒性机制复杂,症状繁多,近几十年的研究也未能找有效的治疗方法。至今已经发现PAs引起HSOS与线粒体的凋亡、细胞凋亡、NO耗竭、氧化应激、血液系统的凝血通路等相关。有研究从基因组学和代谢组学方面发现了PAs与胆汁酸的代谢相关[1],且大量的临床病例中发现PAs引起的HSOS伴有胆汁淤积症状,但是尚无对其相关机制的深入研究。因此本研究综合运用分析化学、药理学、分子生物学等技术手段,从体内外多层面研究菊三七肝毒性与胆汁酸代谢的关联,阐明菊三七的肝毒性机制,以期为临床HSOS的研究提供参考。主要研究内容如下:1.菊三七总生物碱的量-毒关系研究雄性小鼠单次灌胃不同剂量的菊三七总生物碱（TA,30 mg/kg、60 mg/kg、120mg/kg）,,分析其量-毒关系。结果表明,低剂量TA（30 mg/kg）即可引起血清肝功能指标ALT、AST、TBA的升高及肝脏病理切片的改变。中剂量（60 mg/kg）和高剂量（120 mg/kg）TA可造成小鼠饮食、活动减少,从行为外观已发现异常;肝细胞坏死,肝脏出现大面积淤血。给予TA 120 mg/kg剂量,小鼠在24 h后已开始出现死亡,48 h后存活率为零。采用了HPLC/MS检测了肝脏中胆汁酸,发现给药组肝脏胆汁酸谱发生显著变化,胆汁酸含量随剂量显著升高,因此,菊三七中PAs可造成严重的肝损伤,且具有剂量依赖性。2.千里光碱的时-毒关系研究雄性小鼠单次灌胃50 mg/kg千里光碱,于给药后10 min-72 h内不同时间收集样本,研究千里光碱肝毒性的时-毒关系。结果表明,血清中ALT、AST在24 h时达到峰值,其后逐渐下降;HE染色肝窦淤血、坏死等症状也在24 h最为明显,提示可能存在着自身恢复机制。但血清TBA在24 h-72 h内持续升高,提示胆汁酸代谢紊乱对于千里光肝毒性的重要作用。进一步利用HPLC/MS技术检测了小鼠肝脏、血清、胆汁、回肠中胆汁酸的含量,探究给予千里光碱后在不同时间内小鼠胆汁酸池的变化。在肝脏中,小鼠总游离型胆汁酸含量在给予千里光碱10 min时即显著增高（尤其是初级胆汁酸CDCA、αMCA、βMCA）,而总结合型胆汁酸含量呈下降趋势。且此时胆汁中游离型胆汁酸、结合型胆汁酸均呈下降趋势。表明肝脏中胆汁酸和合成增加,而胆汁酸生物转化途径却在减少,胆汁酸毒害性增大。此时回肠中胆汁酸也略微增加。而在给予千里光碱的10min后,一直到2h时,肝脏中游离胆汁酸逐渐下降,血清、回肠中胆汁酸含量大体随着肝脏的变化而变化。可能是胆汁酸升高后,机体的代偿性保护机制调节胆汁酸合成减少。而在12h后,肝脏、血清中胆汁酸胆汁酸游离胆汁酸、结合型胆汁酸均显著性增加,回肠中仅游离型胆汁酸增高。这些结果表明千里光碱在10min时刺激了胆汁酸的合成,此时肝脏中生物转化不足以解决游离型胆汁酸的增多,游离型胆汁酸排入血清,肝脏中对回肠的游离型胆汁酸的吸收减弱。由于胆汁酸含量增多触发机体代偿性保护机制,胆汁酸的合成又逐渐减少,胆汁酸含量逐渐回落。然而由于长时间千里光碱引起肝细胞坏死、肝窦内皮损伤脱落、肝窦内管腔堵塞、胆汁酸长时间的淤积毒害,导致肝脏胆汁酸代谢功能严重的损害,肝肠循环失衡,在24h后胆汁酸游离型胆汁酸增多,外排减少,造成胆汁酸严重的淤积,给肝脏更重的打击。为了探究引起胆汁酸肝肠循环变化的机制,我们检测了肝脏中胆汁酸合成、转运、排泄相关的酶和转运体。结果显示,给予千里光碱后,胆汁酸的核受体Fxr一直处于不同程度的抑制状态。给予千里光碱后10min时,胆汁酸合成酶Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1上调,胆汁酸相关转运体Mdr2、Bsep、Mrp2表达也随着上升,此时胆汁酸含量增多,胆汁酸作为重要信号分子激活Fxr介导的负反馈调节机制,造成胆汁酸合成相关基因Cyp7a1在20min-2h之间逐渐减弱,转运体Bsep、Mrp2基因的转录上调,引起了胆汁酸含量回落。之后Cyp7a1的m RNA的表达在6h-12h又显著上升,此时胆汁酸合成又增多。而在24h后,由于肝脏大面积损坏,肝脏代谢功能大部分丧失,胆汁酸合成酶Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1和转运体基因Mdr2、Bsep、Mrp2的表达一直处于低水平,没有明显变化。此时造成了大量胆汁酸在肝脏中淤积。3.千里光碱抑制核受体FXR活性及对原代肝细胞的影响利用293T细胞为工具,使用双酶素荧光报告基因系统检测了千里光碱对胆汁酸受体Fxr的作用,结果表明千里光碱能直接抑制Fxr的转录活性。此外,采用小鼠原代肝细胞分析千里光碱对细胞的毒性和其对相关胆汁酸合成酶和转运体的影响。结果显示千里光碱可直接降低原代肝细胞存活率,呈剂量依赖性,IC50=5.72?M;且千里光碱诱导了原代肝细胞中胆汁酸合成酶Cyp7a1、Cyp8b1、Cyp27a1的表达呈剂量和时间依赖性。