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木薯(Manihot esculenta Crantz),是一种重要的热带块根作物,由于具有抗旱、耐贫瘠的特点,是热带及亚热带干旱贫瘠地区主要的粮食来源。但目前有关木薯抗旱机制的研究相对较少,尤其是相关基因的功能研究还鲜见报道。前期研究表明木薯在受到干旱胁迫时,其谷氧还蛋白基因(GRX)以及DREB1D基因被显著诱导,但GRX和DREB1D在木薯抗旱中的作用还不清楚。本文中我们系统研究了木薯基因组内的MeGRXs基因家族,同时通过遗传转化体系对MeGRXs以及MeDREB1D基因进行抗旱功能分析。主要结果如下:1通过与拟南芥GRX序列比对,从木薯基因组中筛选出38个MeGRXs。遗传进化树分析显示,38个MeGRXs可划分为四类,分别为CC-type、CPYC、CGFS和GRL,植物特有CC-type GRX含有17个MeGRXs基因,占比最高。表达谱分析显示,17个CC-type MeGRXs中14个受干旱诱导表达,其中6个(MeGRX232、MeGRX360、MeGRX785、MeGRX058、MeGRX892和MeGRX496)在木薯抗旱品种SC124叶片中显著上调表达。2将MeGRX785和MeGRX058过表达及RNA干涉转基因木薯本体进行抗旱功能分析,结果显示过表达MeGRX785木薯植株对干旱敏感,而RNA干涉MeGRX785木薯植株提高了植株的抗旱性。与MeGRX785不同,过表达MeGRX058转基因木薯提高了植株抗旱性,而RNA干涉植株表现为对干旱敏感。同时将MeGRX785和MeGRX058转化拟南芥进行抗旱性分析,结果显示与转基因木薯抗旱评价结果一致,过表达MeGRX785拟南芥植株对干旱敏感,而过表达MeGRX058拟南芥抗旱,表明以拟南芥为模式植物对木薯MeGRXs基因进行功能分析具有可行性。基于上述结果,采用拟南芥遗传转化进行MeGRX232和MeGRX360抗旱功能分析,结果显示过表达MeGRX232拟南芥植株对ABA敏感较弱,对干旱敏感,而过表达MeGRX360拟南芥对干旱表现出一定的抗性,与MeGRX785和MeGRX058抗旱功能差异具有对应性,表明不同Me GRX基因对木薯的抗旱调节具有不同的作用机制。对转基因植株进行相关基因表达谱分析显示,与乙稀调控相关的ERF、GA2OX6等基因在过表达MeGRX232和MeGRX785转基因拟南芥植株中表现为上调表达,可能对两者在干旱负调控作用中起着一定作用,也表明MeGRX可能通过乙稀信号途径对木薯植株进行干旱调控。3对MeGRX785和MeGRX058基因抗旱功能差异进行分析,蛋白序列比对显示,MeGRX785和Me GRX058 C末端ALWL元件的差异,可能是两者抗旱功能差异的主要原因。将两者转化酵母菌株进行转录自激活显色检测,发现MeGRX785酵母转化菌株具有自激活显色现象,而MeGRX058没有,与木薯抗旱功能的差异具有对应性。对MeGRX785和MeGRX058 ALWL元件进行氨基酸删除和突变分析,结果显示删除MeGRX785 ALWL元件及将ALWL第一个丙氨酸(A)突变为甘氨酸(G)将使MeGRX785失去转录自激活现象,但将MeGRX058 ALWL元件的第一个G突变A,MeGRX058产生转录自激活现象,因此得出ALWL元件对MeGRX785的功能作用具有重要作用,且ALWL元件中A位点的差异是引起MeGRX785和MeGRX058功能差异的主要原因。将MeGRX058 ALWL元件突变序列(058mC)转基因拟南芥进行抗旱性评价,结果表明突变序列产生了对干旱的敏感性,验证了ALWL元件中A位点的差异是引起MeGRX785和MeGRX058抗旱功能差异的主要原因。利用氨基酸突变结合酵母遗传转化对MeGRX785中的CDMC、L**LL和P****G蛋白结构域进行功能分析显示,删除L**LL元件的后两个L或将后两个L替换成天冬氨酸(NN),将P****G元件突变为L****G和P****D以及将CDMC突变为ADMA也均使MeGRX785失去转录自激活现象。将MeGRX785 L**LL和P****G元件突变序列(785mLL和785mG)转基因拟南芥进行抗旱性评价,结果显示突变序列失去对干旱的敏感性,表明MeGRX785功能是各结构域综合作用的结果。比较MeGRX232和Me GRX360蛋白序列显示,两者功能结构域无明显差异,但两者的亚细胞定位不同,其中MeGRX232定位在细胞核和细胞质中,MeGRX360主要定位在细胞核中,而是否为其功能差异的原因还有待进一步研究。4表达谱分析显示MeDREB1D受干旱诱导上调表达,基因克隆测序获得两个等位基因MeDREB1D(R-2)和MeDREB1D(Y-3),序列分析显示两者在NLS结构域上有1个氨基酸的差异。亚细胞定位显示MeDREB1D(R-2)主要定位在细胞核中,但MeDREB1D(Y-3)定位在细胞核和细胞质中。抗性分析显示,过表达MeDREB1D(R-2)和MeDREB1D(Y-3)转基因拟南芥均可提高植株的抗旱性和抗寒性。但过表达MeDREB1D(R-2)拟南芥在正常条件下表现为矮化表型和开花延迟现象,而MeDREB1D(Y-3)与野生型无明显差异。对转基因植株进行RNA-Seq分析显示,多个POD基因在转基因植株中显著上调表达,可能是转基因植株抗旱及抗寒性提高的原因。通路分析显示MeDREB1D(R-2)和MeDREB1D(Y-3)在“Photosynthesis”和“Photosynthesis-antenna proteins”通路富集差异较大,MeDREB1D(R-2)转基因植株在两条通路中有28个基因下调表达,但MeDREB1D(Y-3)转基因植株中仅有5个发生变化,其可能是MeDREB1D(R-2)和MeDREB1D(Y-3)转基因植株株高及开花时间差异的原因。上述结果表明,木薯MeGRXs及MeDREB1D基因在木薯抗旱调节分子机制中具有重要的作用,但在MeGRXs家族中不同MeGRX基因对木薯的抗旱调节具有不同的作用机制。这些研究结果将为木薯基因抗旱功能的研究提供参考,为木薯抗旱分子机制的研究以及抗旱品种的培育奠定基础。