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双酚A（Bisphenol A,BPA）作为环境激素（Endocrine disrupting chemicals,EDCs）的典型代表,可引起的男性生精功能异常,是导致的男性不育原因之一,但目前尚缺乏有效的防治方法。枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharide,LBP）是枸杞子的主要有效成分,200 mg/kg/d的LBP可通过抗氧化与抑制凋亡,拮抗BPA引起小鼠睾丸生精功能的损伤,但其最佳的作用时间和其机制尚不明确。由于生精功能与雄激素密切相关,而17α-羟化酶（CYP17A1,Cytochrome P450,family 17,subfamily A,polypeptide 1）是雄激素合成的关键酶,其在睾丸的表达影响精子生成,但其在BPA诱导的小鼠生精障碍中的作用及LBP对其的影响,目前未见报道。因此,在前期研究基础上,探讨在不同时间点的200mg/kg/d的LBP对BPA染毒小鼠生精功能的保护作用,及其对BPA染毒小鼠睾丸CYP17A1的表达的影响,不仅可为探明LBP改善BPA引起的生精障碍作用及机制,而且可为LBP的进一步研发提供可靠的实验依据。第一部分BPA染毒小鼠生精障碍模型的建立目的:制备100mg/kg/d的BPA染毒小鼠生精障碍模型。方法:1)实验分组:采用随机数字表法,将10只昆明SPF级8周成年雄性小鼠,体质量（37±2）g,分为正常对照组（Ctrl组）、模型组（BPA组）,每组5只。2)模型的建立:将BPA溶于玉米油中,100mg/kg/d腹部皮下注射于BPA组小鼠;仅将玉米油0.2ml皮下注射于Ctrl组小鼠的腹部,共计7d。3)睾丸系数测定:两侧睾丸重量/体质量。4)精子密度、畸形率及活率检测:SQA-V精液分析仪检测。5)血清T、E2、T/E2测定:采用放射免疫分析方法检测。6)睾丸HE染色:石蜡切片二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水,苏木精染色,1%盐酸-乙醇分色,1%伊红染色;二甲苯透明,封片。结果:1)与Ctrl组相比,BPA组及两组小鼠造模前后小鼠体质量均无明显变化（P>0.05）;BPA组睾丸重量及睾丸系数均明显降低（P<0.05）。2)与Ctrl组相比,BPA组小鼠精子密度和精子活率均明显降低,精子畸形率则显著上升（P<0.01）。3)与Ctrl组相比,BPA组间血清E2水平无显著改变（P>0.05）,但BPA组T、T/E2值显著降低（P<0.01）。4)BPA组小鼠睾丸生精小管壁受损,基底膜不连续,生精细胞排列紊乱,层数减少,结构不清,腔内精子数量减少,间质细胞分布不均匀。结论:BPA 100mg/kg/d皮下注射,持续7d可诱导小鼠生精功能障碍,BPA染毒小鼠生精障碍模型制备成功。第二部分LBP对BPA染毒小鼠生精功能的保护作用目的:观察200mg/kg/d的LBP在不同时间点对100mg/kg/d BPA染毒小鼠生精功能的保护作用。方法:1)实验分组:采用随机数字表法,将35只雄性小鼠分为7组,各组5只,分别为正常对照组（Ctrl组）、模型组（BPA组）、LBP7d组（7d组）、LBP 14d组（14d组）、LBP 21d组（21d）、LBP 28d组（28d）、LBP 35d组（35d组）。2)BPA染毒小鼠生精障碍模型的建立:同第一部分。3)LBP干预模型小鼠:分别用200mg/kg/d的LBP给BPA染毒模型小鼠的灌胃7d、14d、21d、28d、35d,并于这些时间点称取小鼠体质量,留取睾丸、附睾及血清。4)睾丸系数测定:同第一部分。5)精子密度、精子畸形率和精子活率检测:同第一部分。6)血清T、E2、T/E2测定:同第一部分。7)睾丸HE染色:同第一部分。8)睾丸TUNEL免疫荧光染色:石蜡切片二甲苯脱蜡;梯度酒精脱水;滴加0.1%Triton X–100 50μl,滴加TUNEL反应液50μl,DAPI复染;荧光淬灭,封片。结果:1)与BPA组相比,LBP干预的7d、21d、28d和35d组小鼠睾丸系数均显著升高（P<0.05）,但14d组无明显改变（P>0.05）;7d、35d与21d组间无显著差异（P>0.05）,而28d组显著高于上述3组（P<0.05）。2)与BPA组相比,各LBP干预组小鼠精子密度和精子活率均明显增加,精子畸形率显著降低（P<0.05）;28d和35d和21 d组间无显著差异性（P>0.05）;7d和14d组精子密度和活率显著低于上述3组（P<0.05）,且精子畸形率显著高于上述3组（P<0.05）。3)与BPA组相比,LBP干预21d、28d、35d组小鼠血清T水平组显著增高（P<0.05）,其余各组无显著性差异（P>0.05）;E2水平各组间无显著性差异（P>0.05）;T/E2在14d、21d、35d组均显著升高（P<0.05）,且7d和14d组无显著差异（P>0.05）。4)LBP干预后,各组小鼠睾丸生精小管及生殖细胞损伤,间质细胞不均匀分布程度均有所减轻。5)BPA组睾丸生精小管内凋亡细胞数,明显高于Ctrl组（P<0.05）,且主要在靠近生精小管基膜的精原细胞和初级精母细胞,呈弥散状表达;较BPA组,LBP干预后各组小鼠睾丸凋亡细胞均明显减少（P<0.05）,尤以28d、35d组与21d组无显著差异（P>0.05）,而7d、14d组显著低于上述3组（P<0.05）。结论:LBP对BPA染毒小鼠生精功能具有保护作用,21d效果最佳,时间最短。第三部分CYP17A1在BPA染毒小鼠睾丸的表达及LBP对其的影响目的:观察CYP17A1在BPA染毒和LBP干预后小鼠睾丸的表达,探讨CYP17A1在睾丸的表达与BPA染毒引起生精障碍的关系,以及CYP17A1在LBP治疗BPA染毒引起的生精功能障碍中的作用。方法:1)实验分组与模型建立:同第二部分。2)LBP干预的时间点及剂量:同第二部分。3)免疫组织化学染色:（1）将石蜡切片放入二甲苯;（2）梯度酒精脱水;放入蒸馏水和PBS中各2min。（3）抗原修复。（4）滴加山羊血清,室温孵育。一抗CYP17A1按1:100用PBS稀释。（5）再滴加生物素标记山羊抗兔Ig G二抗。湿盒内4℃过夜。滴加PBS稀释200倍的二抗,湿盒内37℃孵育。（6）滴加HRP标记亲和素,用PBS按1:200稀释,37℃孵育。（7）滴加DAB显色试剂100μl。（8）苏木素中3min后,1%盐酸乙醇中分化3s,返蓝20min。酒精脱水,封片。4)免疫荧光染色:（1）将石蜡切片浸于二甲苯。（2）梯度酒精脱水。（3）滴加山羊血清,湿盒内室温。（4）一抗CYP17A1按1:100用PBS稀释。（5）滴加生物素标记山羊抗兔Ig G二抗。（6）滴加荧光二抗,二者均用PBS1:200稀释。（7）滴加DAPI复染核,盖玻片,封片。5)Western-Blot检测:（1）抽提蛋白质,制备标准曲线。（2）制备蛋白质待测液,BCA反应,计算蛋白浓度。（3）制备聚丙烯酰胺凝胶,蛋白上样液,SDS-PAGE;制备凝胶“三明治”结构,转印槽中转印1.5h。（4）封闭剩余抗原,孵育一抗,（5）孵育二抗:ECL底物发光,封闭抗体,孵育内参抗体。（6）扫描胶片,凝胶图象处理系统检测光密度值。6)RT-PCR检测:上游引物序列为5–TGGGCACTGCATCACGATAA-3′,下游引物序列为5′-GCTCCGAAGGG CAAATAACT-3′;β-actin上游引物:5′CTGTGC C CATCTACGAGGGCTAT-3′下游引物:5′-TTTGATGTCAC GCACGATT TCC-3′。加入1ml Trizol裂解液;抗原修复后离心;加30μl RNase-free dd H2O,得到样本总RNA。测定各样本中RNA的浓度。将上述所得到的RNA样本进行反转录以得到对应的c DNA,检测CYP17A1 m RNA的表达。最后加溶解曲线检测。结果:1)免疫组织化学染色:各组小鼠睾丸间质细胞胞质内均可见褐色的CYP17A1阳性反应物,细胞核为阴性。2)免疫荧光染色:各组小鼠睾丸间质细胞质均可见CYP17A1红色荧光信号,细胞核为阴性。BPA组睾丸间质细胞红色荧光明显低于Ctrl组（P<0.05）,且呈弥散状分布,分布不均匀;LBP干预后,14d、21d、28d、35d组睾丸间质细胞CYP17A1红色荧光信号明显高于BPA组、7d组（P<0.05）。3)Western-Blot检测:BPA组小鼠睾丸CYP17A1蛋白表达明显低于Ctrl组（P<0.05）;与BPA组相比,21d、28d和35d组雄鼠睾丸CYP17A1的表达明显增加,且3组间无显著性差异（P<0.05）,而7d和14d组无明显改变（P>0.05）。4)RT-PCR检测:BPA组小鼠睾丸CYP17A1 m RNA表达明显低于Ctrl组（P<0.05）;与BPA组相比,14d、21d、28d和35d组小鼠睾丸CYP17A1 m RNA的表达显著增加（P<0.05）,且21d明显高于7d、14d、28d和35d（P<0.05）,而7d组无显著差异（P>0.05）结论:1)BPA可能通过抑制CYP17A1的表达,减少T的分泌,影响精子的生成,致小鼠生精功能障碍。2)LBP可能是通过上调睾丸CYP17A1表达,增加T的分泌,保护BPA染毒小鼠的生精功能,且干预21d效果最佳,时间最短。