论文部分内容阅读
目的1.建立同时测定制何首乌（Polygoni Multiflori Radix Praeparata,PMP）中没食子酸（Gal）、5-羟甲基糠醛（5-HMF）、儿茶素（Cat）、表儿茶素（Epi）、2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷（Tet）、大黄素-8-β-D-吡喃葡萄糖苷（Emo-G）、大黄素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷（Phy-G）、大黄素（Emo）、大黄素甲醚（Phy）9种活性成分含量的RP-HPLC方法,建立PMP指纹图谱,评价不同产地PMP的质量,为PMP的开发和利用提供科学依据。2.构建稳定高表达OATP1B1和OATP1B1/MRP2的MDCK细胞模型,为进一步探讨制何首乌对OATP1B1和MRP2介导的胆红素转运的影响提供技术平台。3.利用HPLC检测方法,从分子水平深入探讨并揭示PMP及其主要活性组分对OATP1B1和MRP2介导的胆红素摄取和外排的影响以及引起胆红素相关疾病或不良反应的原因和机制。方法1.PMP中9种活性组分的测定以及指纹图谱的建立（1）按照《中国药典》项下“蒸法”制备PMP。（2）建立RP-HPLC法,检测PMP的主要活性组分。（3）75%乙醇回流提取PMP,制备PMP提取液。（4）建立PMP指纹图谱。2.构建稳定高表达的MDCK/OATP1B1和MDCK/OATP1B1/MRP2细胞模型（1）构建PEGFP-C1/OATP1B1重组质粒并转染MDCKⅡ野生型细胞。（2）采用Q-PCR技术在mRNA水平鉴定SLCO1B1和ABCC2基因是否转录,通过Western Blot确定OATP1B1和MRP2两种蛋白表达,并进一步采用CLSM技术定位蛋白表达位点。（3）用不同浓度丁酸钠作用于MDCK/OATP1B1和MDCK/OATP1B1/MRP2细胞,诱导OATP1B1和MRP2高表达,并确定最佳诱导浓度。3.基于MDCK/OATP1B1/MRP2细胞转运模型研究PMP对胆红素转运的影响（1）建立细胞样品的处理方法和细胞样品中胆红素的HPLC检测方法。（2）考察孵育时间和浓度对细胞摄取和外排胆红素的影响,确定最佳转运条件。（3）研究胆红素在野生型MDCKⅡ细胞和MDCK/OATP1B1/MRP2细胞中的转运及其动力学特征,计算Vmax和Km等动力学参数,考察PMP及其主要活性组分对胆红素转运的影响。结果1.建立了检测PMP主要活性组分的RP-HPLC法,该方法简便、准确、灵敏,精密度好。依此方法测定了不同产地PMP的活性组分含量并建立了PMP指纹图谱。2.构建了稳定高表达的MDCK/OATP1B1和MDCK/OATP1B1/MRP2细胞模型（1）MDCK/OATP1B1和MDCK/OATP1B1/MRP2瞬转细胞通过G418筛选,获得稳定表达的单克隆细胞株。（2）MDCK/OATP1B1细胞的OATP1B1 mRNA表达是野生型MDCKⅡ细胞的394.87±75.89倍（n=3）,MDCK/OATP1B1/MRP2细胞的OATP1B1和MRP2 mRNA表达分别是MDCK野生型细胞的938.40±56.42和633.59±40.90倍（n=3）。野生型MDCKⅡ细胞不表达OATP1B1和MRP2两种蛋白;所构建的MDCK/OATP1B1细胞只表达OATP1B1,且主要定位在细胞膜上;构建的MDCK/OATP1B1/MRP2细胞可同时表达OATP1B1和MRP2两种蛋白,两种蛋白皆位于细胞膜上。（3）不同浓度的丁酸钠诱导蛋白表达的效果不同,随着浓度增大,蛋白表达量增大。丁酸钠诱导蛋白表达的最佳浓度是10 mM。3.基于MDCK/OATP1B1/MRP2细胞模型探讨PMP及其主要活性组分对胆红素转运的影响（1）建立的细胞样品中胆红素的HPLC检测方法专属性好,灵敏度高,精密度好,可用于细胞样品的相关检测。（2）在0-45 min内,胆红素在MDCK/OATP1B1/MRP2细胞的摄取量随时间延长而增加,45 min时趋于转运平衡;胆红素浓度在0.0625-2μΜ时,转运量随浓度增高而增加,当浓度达到0.75μΜ时,转运达到平衡。胆红素在MDCK/OATP1B1/MRP2转运动力学参数Km为0.13±0.02μΜ,Vmax为53.56±1.94 nmol?min-1?mg-1protein。（3）PMP对OATP1B1和MRP2介导的胆红素转运有较强的抑制作用（P<0.05）,其中PMP-4（山东）抑制效果最明显。PMP主要活性组分Emo相对于Tet、Phy和Cat对OATP1B1的转运作用抑制较强,Tet和Cat对MRP2的转运作用具有显著的抑制作用。结论1.成功构建了PMP及其制剂质量控制的“指纹图谱”,提出了《中国药典》中PMP含量测定的修订建议。2.所炮制的PMP符合药典规定,不同产地的PMP中主要指标成分的含量有明显差异,部分产地的PMP质量不合格。3.所构建的MDCK/OATP1B1/MRP2细胞可介导胆红素的摄取和外排,可用于药物转运研究。由PMP引起的黄疸、核黄疸等胆红素相关不良反应或疾病,与其抑制了OATP1B1介导的胆红素摄取和MRP2介导的胆红素外排从而引起胆红素在体内蓄积有关。