草甘膦降解菌苍白杆菌G-1的分离鉴定及草甘膦氧化还原酶基因gox的克隆

来源 :南京农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:ihuangda
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草甘膦及其主要代谢产物氨甲酰磷酸(AMPA)对人体具有遗传毒性,2.5-7.5mM的草甘膦会对DNA产生明显的毒害作用,而1.8mM的氨甲酰磷酸(AMPA)就会对人体淋巴细胞产生明显的诱裂作用。美国一项农业健康调查报告显示,草甘膦及其代谢产物可以诱发多发性骨髓瘤,至于一些罕见癌症是否也与此有联系还需要长期的研究与观察。自然界中存在丰富的降解草甘膦的微生物资源,从这些微生物中克隆的草甘膦降解基因在抗草甘膦转基因作物中有着广泛的应用。从长期受农药污染的环境样品中通过富集培养的方式分离到一株草甘膦高效降解菌,通过16S rRNA基因同源性比较和生理生化鉴定,初步将其鉴定为苍白杆菌属(Ochrobacterum sp.),命名为G-1。菌株G-1在LB培养基上菌落呈圆形,表面凸起,光滑,湿润,边缘规则;在电镜下观察,该菌呈短杆状,没有鞭毛,细胞周围有分泌物;接触酶阳性,脲酶阳性,柠檬酸盐阳性,酯酶阴性,亚硝酸盐还原阳性,不能水解淀粉,不能不能水解明胶;最适生长条件为:pH7.0,温度30℃。好氧性生长,对氨苄青霉素、卡那霉素、庆大霉素、壮观霉素有抗性,对四环素、氯霉素、利氟平呐定酮酸敏感。G-1能在24小时内降解浓度为300mg/L草甘膦,降解效率明显高于以往分离得到的草甘膦降解菌。初始浓度对降解效率有明显影响,初始浓度越高降解时间越长;其最适降解条件为30℃、pH7.0;Cu2+、Ni2+对草甘膦的降解有明显的抑制作用,Zn2+、Ca2+有一定的抑制作用,K+、Fe3+、Mn2+对降解无明显影响。根据已公布的草甘膦氧化还原酶结构基因序列设计特异性引物,通过PCR扩增从降解菌G-1中克隆到草甘膦氧化还原酶的gox基因,gox结构基因共有1296个碱基,编码431个氨基酸和一个终止密码子。将基因序列在NCBI上进行同源性比较,发现该基因与Chelativorans sp. BNC1(CP000389)中的gox基因同源性达99%。将克隆的gox基因连接到表达质粒载体pET-29a上,在E.coli BL21实现了基因的高效表达,并探究酶活测定方法。
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