目的:疟疾是危害人类健康的全球公共卫生问题,其致病机制复杂难以建立长效免疫保护。T细胞介导的细胞免疫在抗疟免疫应答中发挥举足轻重的作用。与疟原虫肝阶段相比,CD8+T细胞在疟原虫红内期发挥免疫病理和免疫保护的作用。经过我们前期研究发现,致死型约氏疟原虫（Plasmodium yoelii 17XL,P.y17XL）感染累及肝脏,大量疟原虫来源的疟色素累积可造成肝组织受损。然而,P.y17XL感染后存活的小鼠,其淋巴结、脾脏和肝脏有大量CD8+T细胞募集。肝脏T细胞介导的细胞免疫应答在青蒿琥酯治愈鼠抵抗P.y17XL再感染中发挥重要的免疫保护作用。目前,疟原虫红内期CD8+T细胞在初次免疫应答和免疫记忆阶段的迁移和组织定位尚未得到充分认识,CD8+记忆T细胞的其形成机制和功能发挥尚待深入开展。为此,本研究通过建立P.y17XL初次感染和再次感染小鼠模型,分析了P.y17XL感染后CD8+效应T细胞、记忆T细胞和耗竭T细胞亚群特点;检测淋巴结、脾脏和肝脏中趋化因子表达差异,结合CD8+T细胞表达的趋化因子受体特点,阐述了趋化因子受体CXCR3和CXCR6在CD8+T细胞功能效应发挥和记忆细胞形成中的作用;采用FTY720阻断淋巴细胞迁移实验,验证了CD8+T细胞在疟原虫红内期感染中的组织趋化特征;利用淋巴结T细胞过继转移实验,明确了CD8+记忆T细胞体内增殖特点及作用途径。本项研究工作的开展,旨在为疟疾免疫防御提供新的作用靶点,为疟疾红内期疫苗的开发提供新的思路。实验方法:1.动物模型建立:1)初次感染模型:雌性BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠腹腔接种P.y 17XL（1×10~6/0.1m L/只,i.p.）。2)P.y 17XL抵抗鼠模型:C57BL/6小鼠初次感染存活小鼠,在初次感染后d30腹腔再次感染P.y 17XL感染红细胞（1×10~6/0.1m L/只,i.p.）。3)FTY720给药:正常健康雌性C57BL/6小鼠随机分为两组,均腹腔感染P.y 17XL感染红细胞（1×10~6/0.1m L/只,i.p.）。从感染当天（d0）起,实验组连续5天灌胃给药FTY720（2μg/0.1m L/只,i.g.,d0～d5）,对照组给予等量无菌水。4)淋巴结CD8+T细胞过继转移实验:经磁珠阳性分选出P.y 17XL抵抗小鼠淋巴结中CD8+T细胞后,尾静脉注射给正常健康C57BL/6小鼠（2×10~6/0.1m L/只,i.v.）,随后过继转移小鼠腹腔注射P.y 17XL感染红细胞（1×10~6/0.1m L/只,i.p.）。5)C57BL/6背景CD45.2小鼠淋巴细胞过继转移实验:正常健康雌性CD45.1小鼠随机分为两组,实验组尾静脉过继转移P.y 17XL抵抗小鼠淋巴结细胞（5×10~6/0.1m L/只）,对照组过继转移同等剂量正常小鼠淋巴结细胞。随后,两组小鼠腹腔感染P.y 17XL感染红细胞（1×10~6/0.1m L/只,i.p.）。2.P.y 17XL感染d3起制备小鼠尾静脉薄血涂片,动态监测小鼠红细胞感染率、生存率。P.y 17XL感染d5取脾脏和肝脏组织制备石蜡切片,HE染色观察脾脏和肝脏组织病理学改变。3.常规方法制备淋巴结、脾脏和肝脏淋巴细胞悬液。流式细胞术检测CD8+T细胞亚群中枢记忆细胞(TCM,CD44+CD62L+)、效应T细胞(TEFF,CD44+CD62L-)、耗竭T细胞(TEX,PD-1+Tim-3+)的数量变化;胞内效应细胞因子IFN-γ和颗粒酶B（Granzyme B,GB）水平;表面趋化因子受体CXCR3、CXCR6和CX3CR1表达差异;记忆CD8+T细胞胞内TCF-1水平;以CD45.1+和CD45.2+示踪过继回输实验研究CD8+T细胞亚群应答特点。针对上述指标,进行脾脏、淋巴结和肝脏组内及组间差异分析。4.获取P.y 17XL初次感染和再感小鼠脾脏和肝脏组织,采用半定量G-Series芯片方法对P.y 17XL感染组织表达的趋化因子水平进行差异分析。实验结果:1.经腹腔感染P.y17XL感染红细胞（p RBC）后,在感染后第5至第8天BALB/c小鼠红细胞感染率持续上升且显著高于C57BL/6小鼠（P<0.0001）,d8达峰值（79.57±3.823%）。C57BL/6小鼠红细胞感染率在d14达峰值（48.19±3.192%）后逐渐下降,至d26镜下无肉眼可见p RBC。在P.y17XL感染后第9天BALB/c小鼠全部死亡,C57BL/6小鼠生存率为78.5%,两组小鼠生存率具有显著性差异（P<0.0001）。P.y17XL感染第5天BALB/c小鼠的肝脏和脾脏较C57BL/6小鼠组织肿胀程度更为明显。BALB/c小鼠脾脏组织结构紊乱,红髓和白髓边界不清,并伴随白髓数量减少,脾小梁结构模糊,疟原虫来源的疟色素出现大量沉积。相较而言,C57BL/6小鼠脾脏结构则较为清晰,红髓和白髓界限清晰分明,并且白髓数量丰富,疟色素沉积亦相对较少。两组小鼠肝脏组织均有少量炎性细胞浸润和疟色素沉积。由此表明,P.y17XL初次感染累及脾脏和肝脏,C57BL/6小鼠比BALB/c小鼠更具有抵抗P.y17XL初次感染的能力。2.为明确两种小鼠在P.y17XL初次感染中的应答差异,我们对脾脏、淋巴结和肝脏CD8+T细胞分化亚群进行了差异分析。流式实验结果显示,感染第5天后,与BALB/c小鼠相比,C57BL/6小鼠脾脏、肝脏和淋巴结中CD8+T细胞占淋巴细胞百分含量及绝对值显著升高（均P<0.05）;脾脏和淋巴结CD8+TEFF细胞（CD44+CD62L-）和TCM细胞（CD44+CD62L+）百分含量和细胞绝对值显著性增加（均P<0.05）,肝脏TEFF百分含量显著升高（均P<0.01）。与C57BL/6小鼠相比,BALB/c小鼠脾脏和肝脏CD8+TEX细胞（PD-1+Tim-3+）百分含量显著升高（P<0.0001,P<0.01）,脾脏CD8+TEX细胞绝对数量亦明显增加（P<0.001）。由此表明,P.y17XL初次感染诱导C57BL/6小鼠CD8+T细胞增殖分化为TEFF和TCM细胞。相比,BALB/c小鼠脾脏和肝脏出现大量耗竭CD8+T细胞,这可能与原虫血症快速升高密切相关。3.进一步对BALB/c和C57BL/6小鼠CD8+T细胞分泌效应分子GB和IFN-γ水平进行差异分析。流式结果显示,与BALB/c小鼠相比,C57BL/6小鼠脾脏和肝脏CD8+GB+T细胞（P<0.01,P<0.05）和CD8+IFN-γ+T细胞（P<0.05,P<0.05）绝对数显著性增多。通过分析平均荧光强度发现,C57BL/6和BALB/c小鼠组内肝脏CTL相较于脾脏CTL效应显著增强,分泌GB和IFN-γ水平显著性升高。由此表明CTL效应功能的发挥在肝脏比脾脏优势更为明显,提示肝脏是P.y17XL初次免疫应答的重要场所,肝脏CD8+T细胞在清除P.y17XL疟原虫感染中发挥重要作用。4.对CD8+T细胞三种趋化因子受体CXCR3、CXCR6及CX3CR1的表达水平进行差异分析。流式结果显示,与BALB/c小鼠相比,C57BL/6小鼠淋巴结CD8+CD44+CXCR3+T细胞（P<0.01,P<0.05）、CD8+CD44+CXCR6+T细胞（P<0.0001,P<0.01）和CD8+CD44+CX3CR1+T细胞（P<0.001,P<0.05）百分含量和绝对值均显著性升高;肝脏和脾脏CD8+CXCR3+T细胞、CD8+CXCR6+T细胞和CD8+CX3CR1+T细胞百分含量均显著性升高（均P<0.05）。由此提示,趋化因子受体在活化CD8+T细胞表面高表达可能介导CD8+T细胞在二级淋巴器官和非淋巴组织间的迁移和募集。5.为探究趋化因子受体在介导CD8+T细胞趋化及功能发挥中的作用,采用淋巴细胞迁移阻断剂FTY720对P.y17XL感染C57BL/6小鼠进行实验观察。结果显示,实验组（FTY720）小鼠红细胞感染率在给药后第4～7天持续上升且明显高于对照组小鼠。截止到感染后第10天,与对照组相比,实验组生存率下降至20%,生存率显著性下降（P<0.05）。FTY720给药后对CD8+T细胞检测分析发现,与对照组相比,实验组小鼠淋巴结中CD8+T细胞百分含量显著性降低（P<0.05）;肝脏和脾脏CD8+T细胞绝对数明显下调（均P<0.05）;脾脏、淋巴结和肝脏CD8+T细胞表面趋化因子受体CXCR3表达水平显著性下调（均P<0.05）。由此表明,CD8+T细胞通过CXCR3介导组织间移行,并对CTL抗疟免疫应答的功能发挥起关键作用。6.以P.y17XL初感小鼠为对照,P.y17XL初次感染存活的C57BL/6小鼠,在感染后d30,接受P.y17XL原虫再次攻击。利用C57BL/6再感染模型,我们对记忆CD8+T细胞亚群特点进行了分析。与对照组相比,实验组小鼠表现出对P.y17XL再次感染的完全抵抗,在实验观察期间镜下未见疟原虫感染红细胞,小鼠生存率达100%。流式结果显示,与初感小鼠相比,再感小鼠脾脏TCM细胞含量显著性增多（P<0.01）,CXCR3+CXCR6+T细胞亚群占脾脏和淋巴结TCM细胞比例显著性升高（P<0.01,P<0.05）。对CTL功能分析发现,与初感小鼠相比,再感小鼠脾脏和肝脏CD8+T细胞高水平表达IFN-γ（P<0.05,P<0.001）,而GB水平无显著性差异（结果未显示）。趋化因子芯片检测结果发现,与初感鼠相比,再感小鼠脾脏Eotaxin和肝脏MIP-2表达显著性升高。由此表明,再感染小鼠体内CD8+T细胞活化后分泌IFN-γ介导脾脏和肝脏炎症发挥抗P.y17XL再感染效应。7.为验证记忆CD8+T细胞体内作用方式及特点,采用过继转移方法,对P.y17XL抵抗鼠淋巴细胞进行分析。磁珠分选P.y17XL抵抗鼠淋巴结CD8+T细胞,静脉回输给正常C57BL/6小鼠,回输正常小鼠淋巴结CD8+T细胞作为对照,两组同时接受P.y17XL p RBCs腹腔感染。在感染后d5流式结果显示,与对照组相比,实验组小鼠脾脏和肝脏CD8+PD-1+TCF1+T细胞数量显著性增多（P<0.05,P<0.01）,CD8+GB+T细胞数量（P<0.05,P<0.05）和CD8+IFN-γ+T细胞数量（P<0.001,P<0.05）均显著性上调。由此提示,过继转移细胞中的CD8+记忆T细胞在受体小鼠体内增殖,进而介导抗P.y17XL感染的CTL免疫应答。为进一步示踪CD8+记忆T细胞体内趋化特点,我们利用CD45.1小鼠作为受体小鼠对P.y17XL抵抗的CD45.2小鼠淋巴细胞进行过继转移。结果显示,实验组淋巴结CD8+CD45.2+T细胞由2.92%（d3）提高至7.32%（d8）,而对照组CD8+CD45.2+T细胞仅由2.4%（d3）升至3.67%（d8）。由此表明,供体小鼠记忆CD8+T细胞在淋巴结内出现快速增殖。感染d3,实验组CD8+CD45.2+CD44+CD62L+TCM（35.9%）细胞量较对照组数量增多（8.82%）,感染d8,实验组CD8+CD45.2+CD44+CD62L-TEFF细胞含量（73.9%）较对照组明显增多（13.4%）。由此表明,供体小鼠记忆CD8+T细胞在体内快速增殖分化为效应记忆亚群发挥CTL效应。结论:1.CD8+T细胞分泌毒性颗粒GB和免疫调节因子IFN-γ介导抗P.y17XL感染的初次细胞免疫应答。2.CXCR3介导CD8+T细胞从淋巴结向脾脏和肝脏趋化发挥CTL效应功能。3.记忆CD8+T细胞活化后分泌IFN-γ介导脾脏和肝脏抗P.y17XL再感染的免疫记忆效应。4.记忆CD8+T细胞的趋化作用为抗疟免疫提供重要保护。