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背景:心房颤动(Atrial fibrillation,AF,简称房颤),是临床上最常见且难以治疗、易复发的一种心律失常,已成为人类心血管疾病中的一大流行病。多种疾病例如缺血性、瓣膜性、炎症性和老年退化性心脏疾病、高血压等均易引发房颤,然而目前房颤的治疗效果尚不尽如人意。大量研究已证实肾素-血管紧张素系统(Renin angiotensin system,RAS)在房颤的发生与维持中被不同程度地激活。血管紧张素II(Angiotensin II,Ang II)是RAS最重要的效应分子,具有收缩血管、促进纤维化增生和心肌肥大等效应,它能被血管紧张素转换酶2(Angiotensin converting enzyme 2,ACE2)转化成为有保护性效应的血管紧张素-(1-7)[Angiotensin-(1-7),Ang-(1-7)]。新近研究表明,过表达ACE2能拮抗Ang II介导的心房重构效应。心房重构是房颤发生和维持的基本机制,改良心房基质成为防治房颤的基础环节。有研究表明,Rac1在心肌细胞中可能经上调结缔组织生长因子(Connective Tissue Growth Factor,CTGF)、N-Cadherin及Cx43这一途径促进了心脏纤维化及心房重构;Rad(Ras Associated with Diabetes)GTPase在心脏中能抑制CTGF的转录,经Rho/Rhokinase途径调节细胞骨架的重塑。然而,在房颤中Rac1和Rad GTPase的动态平衡的调节机制尚不明确,过表达ACE2改善心房纤维化的机制需进一步探讨。目的:本研究拟建立犬心房快速起搏模型,应用心房外膜涂抹携带有ACE2基因的腺病毒的方法探讨心房过表达ACE2对改善犬心房快速起搏所致的心房重构的影响及其分子机制。方法:入选28只成年健康的杂种犬(22±2Kg,雌雄不拘),随机分为4组,每组7只:Sham组(假手术组)、AF-Control组(心房快速起搏对照组)、AF-EGFP组(心房快速起搏+涂染Ad-EGFP腺病毒)及AF-ACE2组(心房快速起搏+涂染Ad-ACE2腺病毒)。其中AF-ACE2组与AF-EGFP组犬心房外膜分别涂染带有ACE2和EGFP的腺病毒,Sham组与AF-Control组犬不涂染腺病毒。除Sham组外,AF-Control组、AF-EGFP组和AF-ACE2组均予以持续心房快速起搏(450次/min)。2周后,4组犬行第一次开胸手术及心内电生理检查(Electrophysiological Study,EP),进行基因涂染。转染3周后行第二次开胸手术及EP检查,随后处死,取心房组织标本进行一下研究:应用苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE)染色和天狼猩红染色评价心房快速起搏所致的组织病理学改变;应用免疫印迹技术评价RAS成员AT1R、AT2R、Apelin和Aplnr的表达,以探讨过表达ACE2对RAS系统的影响;应用免疫组织化学方法和免疫印迹技术评价Rac1、Rad GTPase和Gem的表达,应用免疫印迹技术和免疫组织化学荧光方法评价CTGF、α-SMA和N-Cadherin的表达,应用实时荧光定量RT-PCR方法评价c-jun、c-myc和c-fos的基因表达,以探讨过表达ACE2对心房快速起搏所致的心房纤维化重构的影响。结果:两次开胸手术中心内电生理检查结果相比,第二次手术中AF-Control组、AF-EGFP组及AF-ACE2组犬心房ERP均显著降低,AERP频率适应性也显著下降,而Sham组犬心房ERP在基因转染前后无明显变化。同时,AF-EGFP组(4/7 vs.7/7)和AF-Control组(2/7vs.7/7)犬房性心律失常的诱发率明显上升,且持续时间显著延长,而AF-ACE2组犬房性心律失常的诱发率(4/7 vs.3/7)及持续时间均无明显变化,Sham组犬仅能诱发出短暂的房性心律失常。组织学和分子生物学研究结果:HE染色可见实验犬均无明显出血及炎症渗出等。假手术组细胞间隙适中,纤维排列整齐;AF-Control组和AF-EGFP组心房肌纤维排列紊乱,出现明显的挛缩和断裂;而上述异常在AF-ACE2组明显减轻,与AF-Control组和AF-EGFP组相比,转染ACE2后心房肌纤维分布相对整齐,排列大致有序。天狼猩红染色显示AF-Control组和AF-EGFP组心肌间质纤维化明显,纤维组织增生显著,胶原纤维分布广泛,纤维化程度明显强于Sham组和AF-ACE2组。定量分析结果表明AF-ACE2组的胶原面积明显低于AF-Control组和AF-EGFP组(P<0.0001),与Sham组无明显差异(P=0.234)。免疫印迹技术评价RAS成员的表达,结果显示AF-Control组和AF-EGFP组AT1R蛋白的表达水平显著高于Sham组和AF-ACE2组,而AT2R蛋白的表达水平在AF-Control组和AF-EGFP组显著降低。Apelin和Aplnr的蛋白表达在AF-Control组和AF-EGFP组显著降低,而过表达ACE2则显著升高了两者的表达水平(P<0.05)。免疫印迹技术评价Rac1、Rad GTPase和Gem的表达结果显示:AF-Control组和AF-EGFP组Rac1蛋白的表达水平显著高于Sham组和AF-ACE2组(P<0.05)。而Rad GTPase的表达在AF-ACE2组显著升高(P<0.0001),与Rad同属于RKG家族的Gem在AF-Control组和AF-EGFP组的表达也显著降低(P<0.0001)。免疫组化方法评价Rac1和Gem所得结果与上述免疫印迹法的结果一致。免疫印迹技术评价CTGF、α-SMA和N-Cadherin的表达,结果显示三者在AF-Control组和AF-EGFP组的表达均显著升高,而过表达ACE2则逆转了这一趋势。同时采用免疫组织化学荧光方法检测α-SMA的表达,结果表明α-SMA主要分布在细胞胞浆之中,在AF-Control组和AF-EGFP组中可见大量的绿色荧光细胞且α-SMA的表达强于Sham组和AF-ACE2组,与蛋白印迹的结果相一致。同时,Realtime RT-PCR结果显示c-jun、c-myc和c-fos的基因表达在AF-Control组和AF-EGFP组显著升高,而在AF-ACE2组中过表达ACE2能降低三者的m RNA表达水平。结论:本研究结果表明:(1)过表达ACE2可以降低房颤的诱发率和缩短房颤的持续时间;(2)过表达ACE2调节心房快速起搏所致的RAS失衡,显著下调AT1R的表达,上调AT2R、Apelin和Aplnr的表达;(3)过表达ACE2能调节Rac1和Rad GTPase的动态平衡,显著下调Rac1的表达和上调Rad GTPase、Gem的表达,抑制纤维化相关因子CTGF、α-SMA和N-Cadherin的表达以及下调c-fos、c-jun和c-myc的基因表达,以改善心房纤维化重构。综上所述,本研究结果表明心房过表达ACE2能够通过调节心房快速起搏所致的失衡RAS轴向保护性方向移动、上调Rad GTPase的表达同时下调Rac1的表达、抑制纤维化相关因子的表达这些机制来实现改善心房重构和改良心房基质的目的,从而达到有效降低房颤的诱发率和缩短房颤的持续时间的效果,房颤的防治得到最终获益。