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目的:单纯疱疹病毒（Herpes Simplex Virus,HSV）属于疱疹病毒科成员,是人类常见的病原体。根据血清型不同,HSV分为两个亚型:HSV-1和HSV-2。其中,HSV-1能够通过皮肤、呼吸道和黏膜的密切接触传播,引起人类疾病,如唇疱疹,疱疹性角膜结膜炎及疱疹病毒性脑炎等。HSV-2主要通过性接触传播,引起生殖器疱疹。两种疱疹病毒的共同特点是病程进程快,复制周期短,急性感染后引起终身潜伏感染。目前临床上主要用阿昔洛韦等核苷类似物治疗HSV感染,这类药物通过抑制病毒的DNA聚合酶而发挥抗病毒作用。由于药物在临床上的广泛使用,也导致了耐药病毒株产生,特别是对免疫缺陷患者HSV感染的治疗造成了限制。因此,研发出新的抗HSV感染药物是人们关注的重要课题。中草药在抗病毒感染中发挥了重要作用。大黄为最常用的中药之一,研究发现它有抗氧化、抗炎、抗菌、抗肿瘤和抗病毒等作用,但原料利用率低,剂型简单。本研究在我们前期研究的基础上,拟将纳米技术引入大黄的抗病毒研究,旨在探究纳米大黄在体内外的抗HSV活性及其可能机制,为寻找新型抗疱疹病毒药物提供理论依据。方法:1)纳米大黄的制备与表征选用唐古特大黄,利用纳米粉碎技术,分别通过普通粉碎和超高压纳米均质机进行的高压冲击破碎制备了纳米大黄。用高效液相色谱法（HPLC）测定纳米大黄主要活性成分的含量;通过透射电镜（TEM）考察纳米大黄的形态特征;采用纳米激光粒度仪对纳米大黄进行粒径电位表征。2)纳米大黄的体外抗HSV活性和机制研究培养HEp-2和Vero细胞,加入不同浓度的纳米大黄,采用MTT法测定药物对HEp-2和Vero细胞的毒性作用。HSV感染细胞后,加入不同浓度的纳米大黄,采用空斑减数实验（plaque reduction assay,PRA）检测纳米大黄在不同作用方式下的抗HSV-1和HSV-2活性。通过Time-of-addition实验在病毒感染细胞的不同时间点给药,测定纳米大黄抗HSV-1和HSV-2的作用时相。并以实时定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）检测HSV-1复制相关基因ICP4、ICP8和g D以及HSV-2相关基因ICP27、ICP8和g D的转录水平,蛋白免疫印迹（western blot）探究HSV-1相关蛋白ICP4和ICP8以及HSV-2相关蛋白ICP8和g D的表达变化。同时,采用免疫荧光实验（immunofluorescence assay,IFA）检测HSV-1相关蛋白ICP4和ICP8的表达水平。进一步检测纳米大黄对HSV感染的HEp-2细胞中TNF-α、IL-8、IFN-α及IFN-β的表达影响。3)纳米大黄的体内抗HSV-1活性研究用HSV-1经颅内注射感染小鼠,建立小鼠单纯疱疹病毒性脑炎模型,用不同剂量的纳米大黄治疗病毒感染小鼠,观察小鼠的生存率,中位生存时间,鼠脑中病毒滴度,组织病理变化等指标以及脑组织中病毒相关基因和蛋白的表达变化,评价了不同剂量的纳米大黄对HSV-1感染小鼠的治疗作用,确定药物对HSV-1感染鼠的治疗效果。结果:1)纳米大黄的鉴定与表征HPLC结果表明纳米大黄有效成分与大黄比较,其组成没有发生改变,含量与中国药典保持一致。透射电镜分析显示,纳米大黄呈球形分布,平均粒径约为123.2nm。纳米激光粒度仪的结果显示电位约为-19.93m V,表明纳米粒子在水溶液中能发生聚集。2)纳米大黄对HSV的体外抑制作用纳米大黄对HEp-2和Vero细胞的半数毒性浓度分别为415.3μg/ml和649.8μg/ml。在抗病毒实验研究中,纳米大黄具有抗HSV-1复制的作用,其在HEp-2和Vero细胞上的半数有效浓度(EC50)分别为194.1μg/ml和209.8μg/ml。体外直接灭活实验、抗吸附和抗穿入结果显示纳米大黄也能通过不同的作用方式抑制HSV-1感染。Time-of-addition实验观察到药物在病毒感染后0-15 h的抑制效果较强。纳米大黄可降低HSV-1关键基因ICP4、ICP8和g D m RNA的转录水平,抑制HSV-1 ICP4和ICP8蛋白表达。纳米大黄抗HSV-2复制作用结果显示其在HEp-2和Vero细胞上的半数有效浓度(EC50)分别为188.1μg/ml和228.7μg/ml。对HSV-2具有直接灭活、抗吸附和抗穿入作用,随着药物浓度的增加,抗病毒作用增强。Time-of-addition实验结果显示,在HSV-2感染后的0-12 h加入药物,能得到较高的病毒抑制率,并显著降低病毒复制相关基因ICP27、ICP8和g D m RNA的转录水平,同时下调TNF-α、IL-8、IFN-α及IFN-β的表达,抑制ICP8和g D蛋白的表达。3)纳米大黄体内对HSV-1感染小鼠的保护作用HSV-1感染小鼠表现为厌食、发抖、行动迟缓和死亡等症状。口服不同剂量纳米大黄后,能够提高HSV-1感染小鼠的生存率,延长生存时间并缓解感染小鼠的症状,625 mg/kg/d和312.5mg/kg/d药物处理小鼠的存活率分别提高为60%和30%。病毒感染小鼠后的第五天,小鼠脑组织中的病毒滴度与病毒对照组比较,在625 mg/kg/d给药组以及阿昔洛韦阳性药物治疗组显著降低,脑组织的病理变化、炎症反应有效缓解,鼠脑中病毒的相关基因ICP4和ICP8以及蛋白ICP4的表达水平显著降低。结论:1)制备的纳米大黄,其特征与原药材一致。2)细胞内抗病毒实验证明纳米大黄体外对HSV-1和HSV-2都具有显著的抑制作用,其作用方式可能主要通过影响病毒复制,抑制病毒基因和蛋白的表达以及对细胞因子的调节而发挥抗病毒作用。3)纳米大黄对HSV-1感染的小鼠具有保护作用,延长其生存时间,减轻小鼠脑组织病变程度,对HSV-1引起的疱疹病毒性脑炎有治疗作用。