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白细胞介素-2（IL-2）是一种调控人体免疫系统稳态的极为重要的多功能细胞因子。IL-2最早发现于1976年,是第一个被克隆的细胞因子,也是第一个被证实在治疗癌症和免疫缺陷疾病方面具有临床功效的细胞因子。IL-2是分子量为15.5～16k Da,由四个α螺旋组成的束状Ⅰ型细胞因子。其主要由CD4+T细胞产生。此外,CD8+T细胞,自然杀伤细胞,树突细胞和肥大细胞都可以产生IL-2。在正常状态下,IL-2在体内维持较低水平。而在免疫激活状态下,T细胞受体的调控会使IL-2的产量大量增加。IL-2是通过与靶细胞表面的IL-2受体相结合来实现其功能的。IL-2受体主要有三种存在形式:一为低亲和力受体。此类受体是由单一的IL-2Rα亚基组成的。由于IL-2Rα没有胞内信号传导区域,所以IL-2与此类受体结合不能传递信号以及调控细胞。二为中等亲和力受体。是由IL-2Rβ和IL-2Rγ亚基组成的。此类受体主要在效应T细胞和NK细胞表面表达。IL-2Rβ和IL-2γ都有信号传导区,可与IL-2结合后传递信号。三为高亲和力受体,由IL-2Rα,β和γ亚基共同组成。此类受体主要在调节性T细胞表面表达,对IL-2具有较高的亲和力,这也是调节性T细胞较其他细胞对IL-2更加敏感的原因。IL-2与高亲和力受体的结合过程为先与细胞表面的IL-2Rα相结合,IL-2的空间构象发生改变,可以更容易的与IL-2Rβ相结合,最后与IL-2γ相结合,形成四聚体信号复合物。IL-2的信号传递依赖IL-2Rβ和IL-2γ的胞内区二聚化。此二聚化会激活三条IL-2的信号通路:JAK-STAT,MAKP和PI3K-AKT信号通路。IL-2Rβ和IL-2γ二聚化之后,与β偶联的JAK1分子和与γ偶联的JAK3分子相互磷酸化,并使β上的特定酪氨酸磷酸化。IL-2Rβ的Tyr392 and Tyr510磷酸化后募集STAT5分子并使其磷酸化,磷酸化的STAT5进入细胞核调控靶基因的表达,从而控制细胞的生长,存活和分化。Tyr338磷酸化后募集SHC分子,从而依次激活下游的信号分子。MAKP通路的激活次序为Ras-Raf-MEK-ERK,磷酸化的ERK分子进入细胞核调控基因表达。PI3K-AKT的次序为PI3K-AKT-m TOR-p70S6,p70S6可激活ei F4B和e EF2K等延伸因子,从而调控蛋白合成。早期对IL-2的研究认为它是一种T细胞生长因子,可以促进效应T细胞和NK细胞的增殖,从而提高免疫应答的水平。随着对其进一步研究发现,IL-2是一种多功能的细胞因子,不仅维持着免疫稳态,还调控多种T细胞的分化。IL-2对调节性性T细胞的分化,增殖和功能维持有至关重要的作用。调节性T细胞主要功能是抑制免疫应答,防止过激的免疫反应对正常机体的伤害。敲除IL-2或IL-2Rα的老鼠体内发现调节性T细胞的减少或消失。同时,IL-2还调控Foxp3分子的表达,此分子对于调节性T细胞的功能极为重要。IL-2通过激活STAT5来传递信号,STAT5的其中一个靶基因便是Foxp3基因。因此,IL-2通过上调Foxp3的表达来增强调节性T细胞的抑制功能。在大多数自身免疫疾病中,都会发现效应T细胞和调节性T细胞的比率失衡。调节性T细胞的数量或功能受损,导致自身免疫疾病的产生。同时,IL-2促进TH1,TH2和TH9细胞的分化,抑制TH17和TFH细胞的分化。IL-2被应用于临床治疗已经30多年。其最早是被用于治疗癌症。1998年美国FDA就批准IL-2作为治疗转移性肾癌和黑色素瘤的药物。然而高剂量的IL-2治疗手段却有严重的副作用,比如血管渗漏综合征。过高的毒性也限制了IL-2在临床上的应用。而随着对IL-2在维持调节性T细胞功能的认识上不断加深,对于利用IL-2治疗自身免疫病方面的研究开始变得热门起来。新的治疗也层出不穷。在对IL-2突变体的研究中,Levin等人设计了一种名为“超级因子”的IL-2突变体H9。相对于野生型IL-2,H9的突变位点有L80F,R81D,L85V,I86V和I92F。突变使H9对于IL-2Rβ的亲和力提高了约200倍,而对IL-2Rα和γ的亲和力没有影响。因此,H9可以在不依赖IL-2Rα的情况下与IL-2Rβγ高亲和力结合。在体内,H9可以强力的激活效应T细胞,提高免疫应答水平,从而杀伤癌细胞。从分子水平上解释其作用机理,氨基酸突变使H9的空间构象发生改变,与有IL-2Rα结合后的IL-2空间结构相近。因此,H9本身就容易结合IL-2Rβ。在H9的基础上,Mitra等人又设计出新一代IL-2突变体,他们称之为“受体信号钳”。这一系列突变体包括H9-T（Q126T）,H9-RE（L18R和Q22E）,H9-RET（L18R,Q22E和Q126T）和H9-RETR（L18R,Q22E,Q126T和S130R）。这些突变体仍然保留着对IL-2Rβ高亲和力,而随着突变位点的不断增加,其对IL-2γ的亲和力不断减弱。他们的研究证明了H9-T对于激活T细胞来说和H9具有相同的能力,H9-RE的能力稍微减弱,H9-RET还保留有很少的激活T细胞的能力,而H9-RETR则完全丧失了激活T细胞的能力。在体内,由于这些突变体对于IL-2Rβ的亲和力很高,所以可以竞争内源性的野生型IL-2。而当占据受体之后,H9-RE和H9-RET只有较弱的激活能力,因此可以用作部分激动剂。而H9-RETR则完全不激活T细胞,同时阻断内源IL-2发挥作用,因此可用作IL-2的完全拮抗剂。由于突变削弱了对IL-2γ的亲和力,导致IL-2Rβγ二聚化受阻。对IL-2γ亲和力越低,IL-2Rβ和γ越难以完成二聚化。从而导致β和γ的胞内信号区无法互相靠近并激活,限制了信号向下游的传导。但文献报道的H9和“受体信号钳”的研究只分析了突变体对JAK-STAT信号通路的影响,并未分析突变对于MAPK和PI3K-AKT信号通路的影响。因此,本论文的目的是进一步在细胞水平,分析突变对于IL-2所有信号通路的作用,并且通过探究磷酸化随时间的动态变化,描述突变体诱导的信号传递的时间进程,找出早期磷酸化和去磷酸化的时间段,并利用质谱分析磷酸化肽段来研究突变体和野生型在诱导信号传递有何异同,进而探讨突变体分子作用机制。为此,我们构建了DF-WT IL-2,DF-H9,DF-H9-RE,DF-H9-RET和DF-H9-RETR,来探究突变体对所有信号通路的影响。首先我们全基因合成了WT IL-2和H9-RETR。根据突变体的序列设计引物,并在突变体C端加入两个flag标签（double flag,DF）,用于免疫荧光实验。采用重叠PCR,构建了DF-H9和DF-H9-RE。采用普通PCR,构建了DF-WT IL-2,DF-H9-RET和DF-H9-RETR。利用p ET30质粒作为目的基因的表达载体,将构建好的突变体基因片段连接p ET30,转化到DH5α菌种。通过单克隆菌落筛选,菌落PCR和质粒PCR鉴定,测序公司测序来筛选出含有目的基因的菌种。提取带有目的基因的质粒,转化到BL21菌种,进行突变体蛋白的诱导。筛选出高表达的菌种后,大量扩培并进行诱导表达。采用包涵体纯化的方法纯化突变体蛋白。纯化后的突变体进行SDS-PAGE和western blot实验检测,确保蛋白的纯度和正确性。之后对突变体进行去内毒素处理并采用BCA法测定浓度。利用CTG实验来探究不同突变体对CTLL-2细胞的作用。设置0,5,25,50,100ng/m L浓度梯度的突变体刺激细胞18h,发现DF-WT IL-2和DF-H9具有相同的刺激细胞增殖的能力,DF-H9-RE的激活能力稍弱,而DF-H9-RET和DF-H9-RETR已经丧失了激活细胞的能力。50ng/m L的DF-WT IL-2已经达到了刺激细胞的饱和浓度。在50 ng/m L的DF-WT IL-2的条件下,按0,50,100,500,2000 ng/m L浓度梯度加入突变体,利用CTG细胞增殖实验来探究突变体对野生型IL-2的竞争抑制作用。我们发现DF-H9尽管竞争了DF-WT IL-2,但对细胞活性没有影响。DF-H9-RE部分抑制了细胞活性,而DF-H9-RET和DF-H9-RETR在高浓度时对细胞活性有很强的抑制作用。我们还探究了Mitra等报道中没有研究的突变体对MAKP和PI3K-AKT两条信号通路的调控。利用western blot实验检测STAT5,AKT和ERK信号分子的磷酸化。我们发现突变体对于三条信号通路的调控趋势是相同的。利用突变体刺激5min的情况下,DF-WT IL-2和DF-H9刺激的信号分子的磷酸化都有较高水平且两突变体之间磷酸化程度相同,DF-H9-RE的磷酸化程度相对较弱。而DF-H9-RET和DF-H9-RETR刺激后相对于空白对照组无法检测信号分子的磷酸化。这说明DF-H9-RET和DF-H9-RETR基本上完全抑制了IL-2Rβγ的二聚化,导致结合β后没有信号传导。同时我们的实验也给出证据证明,对于CTLL-2细胞来说,DF-H9-RET和DF-H9-RETR具有相同的抑制效应,可以作为完全拮抗剂使用。同时我们设计了time course实验探究了三条信号通路的在时间上的动态变化。利用DF-WT IL-2和DF-H9刺激细胞,并设置时间点0 s,30s,1 min,5 min,15 min,30 min和2 h。到达刺激时间点,用冷的PBS终止细胞内信号的传递,利用western blot实验检测三条信号通路磷酸化程度随时间的变化。实验结果显示0到5 min为早期磷酸化阶段,磷酸化程度快速上升。5 min到30 min为磷酸化峰值阶段,此时磷酸化程度达到最大,且保持一段时间不变。30 min到2 h为去磷酸化阶段,大部分信号分子去磷酸化,磷酸化水平下降到刺激之前。通过此实验证明了DF-H9对IL-2Rβ的高亲和力并未加快IL-2Rβγ的二聚化进程,也没有明显提高细胞内信号分子的磷酸化水平。通过我们的实验,证实了在CTLL-2细胞中,H9-RE的功能是一个部分激动剂,而H9-RET是一个完全的拮抗剂,和H9-RETR拥有同样的抑制作用。此部分结果与Mitra等报道的突变体在NK细胞中的作用有所区别。说明了突变体对于不同细胞系的激活和抑制作用可能有所不同。同时,我们系统性的研究了三条信号通路的磷酸化程度,证明了突变体对三条信号通路的影响趋势是基本一致的,也说明了突变体不仅调控细胞的增殖,还调控细胞的分化和存活。H9-RE作为一个温和的激动剂,不像野生型IL-2强力的激活效应T细胞。我们推测H9-RE可以作为IL-2的替代品应用于临床,减少其副作用,增加药物的耐受性。H9-RET和H9-RETR可以与IL-2α受体抗体联用,增加其对效应T细胞的选择性,发挥其拮抗剂的作用,从而抑制效应T细胞活性,降低免疫应答反应,治疗自身免疫疾病。磷酸化动态变化的研究提示IL-2信号通路中关键信号分子磷酸化和去磷酸化的时相,为后续的不同突变体之间早期磷酸化蛋白质组学的差异研究提供了理论依据。总之,本论文对IL-2突变体的细胞增殖、信号通路及动态分析的分子机制研究,为下一步设计IL-2突变体、分析其作用机制奠定了良好基础。