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目的:本研究拟通过建立体外结肠癌细胞株模型观察蜂斗菜素对结肠癌细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移,以及在裸鼠异种移植瘤模型中观察其对裸鼠移植瘤生长的影响。通过检测PI3K-Akt-m TOR信号通路的相关分子,初步研究其影响结肠癌细胞生物学行为的机制,为蜂斗菜素的临床应用提供新的实验依据,也为将蜂斗菜素开发成新的抗肿瘤药物之一奠定基础。方法:在体外实验中,采用MTT法检测蜂斗菜素对人结肠癌细胞株Caco-2、Lo Vo、SW-620和HT-29增殖抑制率的影响;采用流式细胞仪Annexine V-FITC/PI染色技术探究细胞凋亡率的变化;采用流式细胞PI染色技术检测细胞周期的变化;采用Hoechst 33258荧光染色法观察凋亡细胞核的变化;采用JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位;使用划痕愈合实验测试对细胞迁移能力的影响;Transwell实验用于探究细胞的侵袭能力的变化;采用PCR法检测细胞PI3K-Akt-m TOR信号通路相关m RNA(Akt、m TOR、P70S6K、MMP-3、MMP-9、Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2)的表达水平;并采用Western blot法检测细胞PI3K-Akt-m TOR信号通路相对应的蛋白表达水平的变化情况。在体内实验中,通过小鼠急性毒性实验,采用Bliss法计算蜂斗菜素的半数致死剂量(LD50)。建立裸鼠人结肠癌SW-620细胞移植瘤模型,将蜂斗菜素处理组与阴性对照组和5-FU阳性对照组进行比较,分别测量并记录瘤移植后0 d、7 d、14 d、21 d和28 d裸鼠瘤体积值。通过H-E染色观察其对移植瘤组织中肿瘤细胞组织病理学的影响;通过TUNEL荧光染色法研究其对移植瘤组织中肿瘤细胞凋亡的影响;通过免疫组化染色研究其对移植瘤组织中肿瘤细胞Ki-67和p53表达的影响。采用Western blot法检测裸鼠人结肠癌SW-620细胞移植瘤组织中PI3K-Akt-m TOR信号通路相对应的蛋白表达水平的变化情况。结果:在体外实验中,蜂斗菜素(1,5,25μmol/L)显著抑制四株人结肠癌细胞株Caco-2、Lo Vo、SW-620和HT-29的体外增殖,其中高剂量蜂斗菜素(25μmol/L)对SW-620细胞的增殖抑制最强,其24 h、48 h和72 h的增殖抑制率分别为(21.16±3.59)%、(38.52±4.55)%和(47.15±7.65)%。蜂斗菜素(25μmol/L)对SW-620细胞周期无显著影响(p﹥0.05),但能够著升高SW-620细胞凋亡率[(6.01±1.56)%vs(31.03±3.52)%,p<0.01],能够诱导SW-620细胞线粒体膜电位的下降[(3.22±0.49)%vs(0.25±0.09)%,p<0.05],并引起细胞核形态凋亡性改变[(2.31±0.13)%vs(26.13±5.62)%,p<0.05)。24 h划痕愈合试验结果显示,对照组细胞的愈合比为(68.1±9.6)%,而蜂斗菜素组的愈合比仅为(21.1±2.3)%,提示蜂斗菜素可显著抑制SW-620细胞的侵袭能力(p<0.01)。Transwell实验显示,与对照组的侵袭细胞数(268.01±35.51)相比,蜂斗菜素处理组的侵袭细胞数(61.33±10.97)显著减少(p<0.01)。RT-PCR结果显示蜂斗菜素可明显抑制MMP-3(1.25±0.19 vs 0.71±0.14)、MMP-9(1.17±0.12 vs.0.75±0.11)、Bcl-2(0.72±0.09 vs 0.43±0.08)在m RNA水平的表达(p<0.05;p<0.05;p<0.05),诱导Casepase-3(0.98±0.13 vs 1.78±0.33)和Caspase-9(1.09±0.31 vs 1.95±0.36)m RNA水平的表达(p<0.05,p<0.05),但Akt(1.21±0.21 vs 1.20±0.13)、m TOR(1.03±0.17 vs 1.09±0.21)、P70S6K(0.94±0.13 vs 0.89±0.09)基因水平无显著性变化(p﹥0.05)。Western blot结果显示,与对照组比较,蜂斗菜素可显著抑制结肠癌SW-620细胞中Akt(1.01±0.16 vs 0.74±0.06)、m TOR(0.71±0.12 vs 0.32±0.11)和P70S6K(1.23±0.21 vs 0.85±0.14)蛋白的磷酸化水平(p<0.05;p<0.05;p<0.01),而对总的Akt、m TOR和P70S6K蛋白水平没有显著影响。蜂斗菜素明显抑制了肿瘤侵袭转移相关蛋白MMP-3(1.51±0.31 vs0.82±0.11)和MMP-9(1.56±0.32 vs 0.94±0.15)的表达水平(p<0.05;p<0.05),增加了凋亡相关蛋白cleaved Caspase-3(0.41±0.09 vs 0.74±0.12)和cleaved Caspase-9(1.10±0.27 vs 1.98±0.22)的表达(p<0.05;p<0.01),同时降低了凋亡抑制蛋白Bcl-2(2.75±0.47 vs 1.51±0.36)的表达(p<0.01)。在体内实验中,小鼠的急性毒性试验得出蜂斗菜素的LD50值为68.65 mg/kg。与对照组相比,蜂斗菜素(10 mg/kg)和5-FU(20 mg/kg)均可显著抑制裸鼠移植瘤体积增长[21天:对照组(488.90±48.60mm3)、蜂斗菜素组(289.22±22.59mm3)、5-FU(192.89±21.33 mm3)(p<0.05,p<0.05);28天:对照组(924.18±101.23mm3)、蜂斗菜素(577.67±75.13mm3)、5-FU组(304.59±62.51mm3)(p<0.01,p<0.01)],即抑制移植瘤的生长。H-E染色和TUNEL调亡检测显示,蜂斗菜素可抑制荷瘤裸鼠肿瘤细胞生长,显著增加荷瘤裸鼠肿瘤细胞调亡比率[蜂斗菜素组:(35.72±0.73)%vs(3.63±0.73)%(p<0.01;5-FU组:(49.67±2.70)%vs(3.63±0.73)%,p<0.01]。与对照组比较,蜂斗菜素显著降低移植瘤组织中Ki-67染色阳性细胞比率[(63.50±10.05)%vs(43.75±4.51)%,p<0.05],增加p53染色阳性细胞比率[(23.75±2.22)%vs(36.26±6.55)%,p<0.05]。蜂斗菜素可显著抑制结肠癌细胞SW-620裸鼠移植瘤中Akt(0.35±0.04 vs 0.15±0.01)、m TOR(0.84±0.16 vs 0.32±0.09)和P70S6K(0.63±0.17 vs 0.26±0.05)蛋白的磷酸化水平(p<0.05;p<0.05;p<0.05),而对总的Akt、m TOR和P70S6K蛋白水平没有显著影响;抑制MMP-3(0.46±0.12 vs 0.16±0.06)、MMP-9(0.52±0.17 vs 0.25±0.04)和Bcl-2(0.91±0.24 vs 0.71±0.15)的表达水平(p<0.05;p<0.05;p<0.05),增加cleaved Caspase-3(0.19±0.09 vs 0.59±0.16)和cleaved caspase-9(0.32±0.13 vs 0.98±0.32)的表达(p<0.05;p<0.05)。结论:蜂斗菜素在体外和体内模型中对结肠癌SW-620细胞均有显著的抑制作用,其能够抑制结肠癌SW-620细胞的体外和体内增殖,诱导细胞凋亡,抑制细胞侵袭和转移,其作用机制可能涉及到PI3K-Akt-m TOR信号通路的调控。